人工構建基因回路有兩種常用的策略。第一種是基于理論設計的“即插即用”模式，研究者利用已被定量刻畫的基因元件，結合理論計算模型來構建基因回路，以使之產生特定功能。第二種則是基于高通量篩選的定向進化，或“突變-篩選”模式，在此模式下，研究者往往需要對回路中重要的原件構建規模龐大的突變體文庫并隨后進行篩選，以獲得所需的表型。

對于后者而言，盡管大規模的建庫-篩選技術近年來已經得到了長足的發展，然而對于一些復雜的表型，特別是涉及到時間依賴的動力學行為時，同時記錄大規模突變體庫的動力學表型是困難的。近期，美國加州大學圣地亞哥分校Jeff Hasty課題組在Cell Systems上發表以“Design， mutate， screen： Multiplexed creation and arrayed screening of synchronized genetic clocks”為題的研究論文，介紹了其新開發的微流控芯片，基于此芯片可以在顯微鏡下同時記錄大量細胞群體的動力學行為。

圖1 Hasty實驗室開發的微流控芯片，可以同時追蹤48個細胞群體的動力學。

應用這一微流控系統，研究人員對實驗室已有的群體振蕩基因回路進行了突變-篩選。該基因回路利用細菌的群體感應系統，通過AHL分子進行細胞間通訊，使細胞群體以共同的節律表達細胞裂解相關蛋白，從而產生群體的同步化振蕩（如圖2所示）。研究人員首先對裂解蛋白的核糖體結合位點（RBS）序列中的五個位點進行了突變，并隨機選取其中24個分別用96孔板和微流控系統進行篩選。結果表明，在96孔板中生長的細菌群體無法表現出規則的振蕩行為，而在微流控篩選系統中則可以表現出周期性振蕩。研究人員進一步定量測定了不同突變體在不同條件下的振蕩周期和振幅，并展示這一系統可以用于精確調整振蕩系統的動力學性質。

圖2 應用微流控系統規模化篩選具有不同振蕩周期的菌株

接著，研究人員挑選篩選所得的兩個菌株（pSpSLC?和pSpSLC??，以下簡稱0號和10號）進行了深入分析。相比而言，10號菌株的振蕩更慢，振幅更高。研究人員首先在無反饋的菌株內刻畫了兩種RBS的強度，并畫出了兩種RBS下細胞裂解對AHL的劑量響應曲線，發現0號菌株（快振蕩）的EC50要顯著小于10號菌株（慢振蕩）的EC50值，這一結果與數學模型定性地吻合。

圖3 更慢的振蕩周期對應更強的AHL響應

此外，研究人員應用前任發展的RBS計算器對這兩個篩選得到的RBS序列進行了強度預測，但結果顯示二者并沒有明顯區別（在誤差精度范圍內）。研究人員分析產生這一結果原因可能在于下游裂解蛋白濃度與細胞裂解之間的非線性關系，即微小的RBS強度改變也可能帶來細胞裂解水平的很大變化。這進一步說明了規模化文庫篩選的重要性——即便是在很大程度上可以被理性設計的基因回路中，也會有潛在的、未被充分考慮的復雜性。

最后，研究人員應用這一篩選平臺構建了一個不依賴于細胞裂解的新型群體振蕩回路。該回路由簡單的負反饋構成：細菌表達產生的AHL可以誘導tetR的表達，而tetR又可以抑制AHL的表達。初始構建的菌株并未表現出明顯的振蕩特征，研究人員隨后對tetR的RBS構建了突變體文庫，并選擇其中在分批培養條件下具有脈沖式動力學現象的菌株進行了微流控平臺篩選，最終得到了具有穩定振蕩表型的菌株。相比初始菌株而言篩選得到的菌株明顯具有更穩定的振蕩周期。

圖4 篩選前后細胞群里動力學的對比（c圖上半部分為篩選前的細胞群體動力學，下半部分為篩選后的群體動力學，可以看到發生了規律的周期振蕩）。

綜上所述，研究人員開發了一種可以規模化篩選細胞群體動力學的技術平臺，應用這一平臺可以有效地獲得具有預期的定量表型的菌株，并可以用來篩選產生全新動力學行為的菌株（從衰減振蕩到持續振蕩），為復雜基因回路的規模化篩選與定向進化提供了新的思路和工具。

原文標題：基于微流控芯片的分子鐘基因回路的高通量設計與篩選技術

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