學術動態 | 干細胞樣腫瘤細胞的Midkine表達驅動mTOR抑制和免疫抑制微環境的持續 （一）

文章詳情

圖解摘要

我們之前詳細介紹了研究者對AML 和 LAM的單細胞分析、AML細胞中的通路和遺傳調控網絡的圖譜以及AML腫瘤細胞表現為兩種主要狀態:干細胞樣和炎性，現對接下來中間部分的內容進行詳細介紹。

03

研究內容

AML細胞的干細胞樣細胞群可能與雷帕霉素耐藥有關

研究者觀察到腫瘤細胞亞群的干性和休眠性增強，這是耐藥性腫瘤細胞的典型特征，這促使研究者直接研究雷帕霉素在AML細胞中的耐藥性。他們從本研究分析的AML腫瘤之一做了原代培養，并用DMSO（對照）或雷帕霉素（實驗）處理這些細胞，然后進行scRNA-Seq分析（圖3a），聚類確定了7個細胞群（圖3b），AML細胞占33%（圖3c）。集群4包含來自對照組和雷帕霉素治療組的AML細胞，表明它包含對雷帕霉素有抵抗力的細胞，或者至少是轉錄沒有被雷帕霉素治療改變的細胞。在這個集群中，許多AML腫瘤標志基因的表達不受雷帕霉素的影響，而在其他集群中雷帕霉素抑制了這些腫瘤基因的表達，例如CTSK（圖3d）。此外，第4群中的細胞顯示出高干性評分（圖3e）和高休眠評分（圖3f和補充圖6c）。NR2F1調節子的活性在這個簇中也很高（圖3g）。

據報道，MDK在其他腫瘤中介導耐藥性，為了確定MDK是否參與雷帕霉素耐受，以及MDK是否受TSC途徑的調節，研究者使用了兩種TSC的細胞模型，發現與TSC2-reexpressing 621-103細胞相比，在TSC2缺陷的AML患者衍生的621-101細胞中，以及與TSC2-add back TTJ+ TSC2細胞相比，MDK的表達上調了（圖3h）。與對照組相比，患者來源和小鼠來源的TSC2缺陷細胞系中的MDK水平都明顯升高（圖3i）。接下來，研究者用DMSO、雷帕霉素（20 nM）、iMDK（MDK抑制劑，1 μM）或雷帕霉素（20 nM）和iMDK（1 μM）的組合處理TSC2缺陷細胞（621-101，TTJ）和正常人類成纖維細胞（NHLF）。在所有3個細胞系中，單獨使用iMDK處理的效果最小。當與雷帕霉素結合時，iMDK對兩個TSC2缺失的細胞系有協同作用（圖3j）。他們將協同作用定義為兩種藥物的綜合效果大于每種藥物的單獨活性之和。為了確定iMDK是否在體內使腫瘤對雷帕霉素治療敏感，他們使用TSC2缺陷的TTJ細胞在免疫缺陷的無胸肌裸鼠體內產生皮下腫瘤。與單獨使用雷帕霉素相比，iMDK和雷帕霉素的聯合治療導致了更快的腫瘤反應的發生，以及更低的腫瘤負擔，而單獨使用iMDK沒有明顯的效果（圖3k，補充圖6d）。

圖3. AML細胞的干細胞群可能有助于雷帕霉素的抗性a

異質性腫瘤細胞狀態對內皮細胞的重塑

研究者探究了SLS和IS對腫瘤微環境的潛在不同影響。在6個AML樣本中，2個AML主要由IS組成（>70%），4個主要是SLS（>80%）（圖4a）。以SLS為主的腫瘤有更多的內皮細胞（圖4b）。為了驗證這一點，他們對每個AML進行了內皮細胞標記物CD31的免疫組化（IHC）染色，發現與scRNA-Seq預測的百分比有很強的相關性（圖4c），在SLS主導的腫瘤中內皮細胞的百分比更高（圖4d，補充圖7a）。差異表達分析顯示，MDK的表達要比VEGFD高得多，MDK在群集1（SLS）中表達較高，而VEGFD在群集3（IS）中表達較高 (圖4e)。這些數據表明，SLS腫瘤中促血管生成的MDK的高表達可能是該亞型AML中富含內皮細胞的原因。

圖4. 以SLS為主的腫瘤的內皮細胞重塑

scRNA-Seq和scTCR-Seq的綜合分析揭示了SLS優勢腫瘤的T細胞功能障礙和抑制的克隆擴展

在人類TSC腫瘤中已經觀察到T細胞的浸潤和衰竭，并且在小鼠模型中觀察到免疫療法的明顯益處。為了確定T細胞是否受到AML中腫瘤細胞狀態的影響，研究者重點研究了4個與正常腎臟配對的AML，其中2個以SLS為主，2個以IS為主。對腫瘤來源的CD8+T細胞進行重新聚類，發現了3個主要的細胞群：記憶/免疫T細胞（CD8 Tm/naive）、效應T細胞（CD8 Teff）和增殖T細胞（CD8 T-prolif），以及每個主要細胞群中的亞群，它們具有不同的免疫檢查點基因或細胞毒性效應基因的表達（圖5a，b）。來自SLS優勢腫瘤的CD8+T細胞與來自IS優勢腫瘤的CD8+T細胞相比，顯示出更低的細胞毒性分數，而且每個亞群內的細胞毒性細胞（定義為表達至少一種細胞毒性效應基因）的百分比也較低（圖5c）。此外，SLS主導的腫瘤衍生細胞表現出更高的衰竭分數（圖5c）。盡管每個亞群中衰竭細胞的頻率大致相同（圖5c），但SLS主導的腫瘤中衰竭的CD8+Teff細胞的比例高于IS主導的腫瘤，而IS主導的腫瘤顯示出更高的細胞毒性CD8+Teff和CD8+Tm/Naive群體的頻率（圖5d）。對腫瘤來源的CD4+T細胞的類似分析顯示了6種CD4+T細胞的亞型（圖5e，f）。雖然來自IS顯性腫瘤的記憶型CD4+T細胞和CD40LG高的群體顯示出較高的細胞毒性分數（圖5g），但在SLS顯性腫瘤和IS顯性腫瘤之間沒有觀察到任何亞型的細胞頻率的明顯差異（圖5h）。

腫瘤激活的淋巴細胞會發生克隆性擴增，來自同一克隆的擴增T細胞具有相同的TCR序列（克隆型）。研究者發現在以IS為主的腫瘤中，有229個克隆型在CD8+T細胞亞型中共享，319個克隆型在CD4+T細胞亞型中共享，但在以SLS為主的腫瘤中只有5個克隆型在CD8+T亞型中共享（圖5i）。SLS腫瘤在CD8+T群體中顯示出相當有限的亞型之間的克隆型共享，而在CD4+T群體中沒有克隆型共享，而IS腫瘤在CD8+T和CD4+T群體中都顯示出亞型之間廣泛的克隆型共享（圖5j）。CD8+ Teff亞型中75%的擴增TCRs與IS腫瘤中的CD8+ Tm/Naive亞型共享，顯示了這兩種CD8+ T細胞狀態之間的動態聯系。在IS腫瘤中，大多數增殖的CD8+T細胞與CD8+Teff群體共享克隆型，這可能意味著腫瘤抗原反應性T細胞增殖（圖5j）。增殖的T細胞與兩個細胞毒性Taff群體（CD8 Teff-TNF和CD8 Teff-IFNG）共享大量的克隆型。此外，在CD8 Teff和兩個細胞毒性Teff群體（CD8 Teff-TNF和CD8 Teff-IFNG）之間觀察到廣泛的克隆共享，這表明向功能性T細胞分化的軌跡是活躍和動態的。這些觀察結果表明，在IS腫瘤中觀察到的高頻率的細胞毒性CD8+T細胞，至少部分是由于可能的腫瘤識別效應細胞的動態分化。研究者使用RNA速率分析支持了從CD8效應T細胞到增殖T細胞以及從多個CD4+T亞群到Tregs的分化軌跡（圖5k）。相反，以SLS為主的腫瘤顯示出亞型之間有限的分化潛力。

圖5. 在SLS主導的腫瘤中，T細胞功能紊亂和T細胞克隆擴展受到抑制

經過今天的介紹，小伙伴們是不是對文章有了一個更深入的了解呢，在明天我們會介紹文章的最后一部分內容—研究者對SLS和IS的腫瘤免疫微環境所做的研究，讓我們共同期待吧！

SBC 單細胞測序平臺

單細胞轉錄組測序（Single-cell RNA-sequencing）是指在單細胞水平上對RNA進行高通量測序和分析的新技術。公司（中心）建立的單細胞測序的主流平臺——10x Genomics Chromium，可提供大規模、靈活、全面的單細胞測序服務，包括單細胞轉錄組、單細胞免疫組庫、單細胞ATAC-seq、單細胞ATAC+轉錄組測序等。經過多年的積累，現已形成從樣本保存、運輸、單細胞懸液制備，到單細胞分選、建庫和數據分析的一站式解決方案。目前已為來源于人、小鼠、大鼠、斑馬魚等多種物種的臨床和科研樣本提供了單細胞測序和數據分析服務。

SBC 空間轉錄組測序平臺

空間轉錄組學技術能夠測定組織樣本中（冰凍和石蠟樣本）的所有基因表達圖譜，并定位具體發生的位置信息。公司（中心）建立的10x Genomics Visium空間轉錄組測序平臺，無需進行目標預設就可以在空間上實現組織中基因表達的可視化。通過數據分析和數據可視化，將基因表達數據映射到圖像上，實現對同一樣品基因表達和細胞組成空間結構的表征，以從組織切片中獲得生物學的全貌。