COVID-19表現出不同的疾病嚴重程度和癥狀，包括急性全身性炎癥和高細胞因子血癥，隨后出現免疫細胞調節異常。COVID-19中的細菌重復感染可使病程進一步復雜化，并與死亡率增加有關。然而，人們對SARS-CoV-2的發病機制和高細胞因子血癥如何阻礙對抗細菌重復感染的先天免疫功能的了解有限。因此，研究者評估了COVID-19急性期患者和相應恢復期患者的COVID-19血漿高細胞因子血癥對髓系免疫細胞對細菌挑戰的功能反應的影響。研究者發現COVID-19患者嚴重的高細胞因子狀態與細菌重復感染的發展相關。接受地塞米松治療的COVID-19患者血漿中總體炎癥標志物顯著降低，并對體外細菌挑戰表現出增強的免疫反應。最后，廣泛的抗炎治療與COVID-19危重患者CRP、IL-6水平以及ICU住院時間和通氣天數的降低有關。

01研究思路

1. COVID -19介導的高細胞因子血癥與隨后的細菌重復感染相關

研究者試圖調查在ICU住院期間發生繼發性細菌感染(細菌重復感染)的COVID-19患者與未發生細菌重復感染的患者的細胞因子水平是否存在差異。主成分分析(PCA)顯示，在COVID-19患者急性期和rec期測量的細胞因子與健康供體分開聚集(圖1A)。發生細菌重復感染的急性期(圖1B)和rec期COVID-19患者(圖1C)與未發生細菌重復感染的患者(圖1A-1C)相比，其密度曲線上的分離度均有所增加。發生細菌重復感染的患者在急性期和rec期均表現出顯著升高的累積細胞因子水平(炎癥指數)(圖1D)。

圖1 COVID-19血漿中炎癥介質的特征及其與細菌重復感染的關系

2、急性期COVID-19患者中性粒細胞和單核細胞對細胞內細菌的清除減少

研究者進一步評估了體外細菌挑戰時中性粒細胞和單核細胞的功能。在用肺炎鏈球菌(SP)或金黃色葡萄球菌(SA)進行細菌感染之前，先用自體或異源血漿培養來自COVID-19危重患者或健康供體的中性粒細胞和單核細胞(圖2A-2D)。研究者觀察到，與健康血漿刺激相比，來自COVID-19患者或健康捐贈者的中性粒細胞和單核細胞與急性期COVID-19血漿孵育后，細胞內殺菌功能受損，清除細菌的能力顯著降低(圖2A-2D)。

圖2 急性期COVID-19患者先天性免疫細胞胞內殺菌能力受損

3、急性期COVID-19患者對細菌挑戰的中性粒細胞效應反應受損

接下來研究者評估了與急性期COVID-19中性粒細胞細胞內殺傷能力降低有關的因素，研究者分析了關鍵的中性粒細胞效應反應。用急性期COVID-19血漿刺激急性期患者或健康供體的中性粒細胞，與用健康血漿刺激相比，細菌攻擊時ROS水平顯著降低(圖3A)，髓過氧化物酶(MPO)水平顯著降低(圖3C(左))。急性期患者的中性粒細胞比來自rec期患者或健康供體的中性粒細胞表現出更高數量的自發細胞外DNA釋放(圖4A(上))和更高水平的MPO-DNA復合物(圖4A(下))。然而，與rec期患者或健康供體的中性粒細胞相比，細菌攻擊導致急性期患者中性粒細胞中細胞外陷阱(NETs)和MPO-DNA復合物的釋放顯著降低(圖4B-4D)。

圖3 急性COVID-19患者對細菌挑戰的中性粒細胞效應反應受損

圖4 在繼發性細菌挑戰時，COVID-19患者中NETs受損

4、急性期COVID-19患者的中性粒細胞信號轉導改變進一步表征了功能障礙的表型

鑒于觀察到急性期COVID-19患者的中性粒細胞效應反應受損，研究者研究了中性粒細胞潛在的關鍵信號傳導機制和受體表型。急性期患者的中性粒細胞趨化因子受體CXCR2、CXCR3和CCR5的表達明顯降低(圖5B和5F)。此外，研究者觀察到急性期患者中性粒細胞中活化標志物CD66b水平較高(圖5C)。在細菌感染后，在急性期COVID-19患者的中性粒細胞中發現了類似的細胞表面受體表型模式(圖5A-5F)?？傮w而言，COVID-19急性期患者的PCA與rec期患者和健康供體明顯分離，表現出強烈的受體表型聚類，而rec期和健康對照組在很大程度上重疊(圖5G-5I)。最后，研究者研究了COVID-19患者中這種獨特的中性粒細胞表型是否也以細菌攻擊時參與自分泌-旁分泌信號傳導的細胞因子產生受損為特征。具體結果見圖5J-5K。

圖5 中性粒細胞表面標記物的表達及細胞因子的分泌

5、COVID-19中單核細胞亞群信號轉導的改變表征了抗菌表型受損

急性期患者的經典單核細胞表現出更多的異質性，與恢復期和健康期單核細胞相比，CD163、CX3CR1表達較高，HLA-DR表達較低(圖6A)。細菌攻毒后，來自COVID-19患者(急性期和rec期)的經典單核細胞顯示CD163和CD11b高表達，但激活標志物HLA-DR、CD86和CD80低表達(圖6A -6D)。總的來說，經典單核細胞的PCA在細菌攻擊時顯示出急性期COVID-19聚集模式，這與HLA-DR、CD86、CD80低表達和CD163、CX3CR1和CD11b高表達密切相關(圖6G-6I)。最后，與健康對照組相比，細菌攻擊時COVID-19單核細胞顯示細胞因子分泌抑制(圖6J和6K)。

圖6 細菌攻擊時單核細胞表面標記物和分泌細胞因子的表型特征

6、TNF-α、IFN-γ和IL-4聯合抑制COVID-19危重患者髓系免疫細胞抗菌效應功能受損

研究者比較了2020年3月至6月第一波危重患者的血漿細胞因子水平與2020年7月至12月第二波危重患者的血漿細胞因子水平，并按是否存在細菌重復感染情況進行分層。根據恢復試驗，地塞米松治療是在第二波治療期間進行的。細胞因子的PCA值顯示急性期或rec期患者之間以及細菌重復感染狀態之間有明顯的區別(圖7A)。此外，對于在ICU住院期間出現細菌重復感染的COVID-19危重患者，在PCA中觀察到細胞因子的清晰聚類(圖7B)。為了研究這種特定細胞因子簇在中性粒細胞和單核細胞功能反應能力重疊感染患者中的潛在作用，研究者使用細菌攻擊前的單個細胞因子或細胞因子組合對健康供體中性粒細胞進行細胞因子刺激試驗。他們發現了五種細胞因子的強烈作用，導致中性粒細胞中細胞內細菌存活增加(圖7D)。當不同的細胞因子組合刺激細胞時，這種表型顯著增加。具體結果見圖7E-G。最后，研究者確認了這些已確定的細胞因子在觀察到的COVID-19髓系免疫細胞抗菌效應功能受損中的重要性：TNF-α、IFN-γ或IL-4受體的阻斷會導致細胞內細菌存活率降低，而TNF-α和IFN-γ或TNF-α、IFN-γ和IL-4受體的阻斷會導致細胞內細菌存活率顯著降低(圖7H)。

圖7 根據重復感染狀態和功能性細胞因子分析定量COVID-19患者血漿細胞因子水平

7、血漿蛋白質組學顯示，在接受地塞米松治療的COVID-19危重患者中，炎癥介質減少

除了分析COVID-19急性期和rec期的血漿細胞因子水平外，研究者還試圖確定血漿中是否有其他可溶性蛋白可能是骨髓免疫細胞抗菌效應反應受損的驅動因素。研究者通過TIMS-TOF-MS對這些患者血漿中的蛋白質變化進行了評估。他們在33份血漿樣本中共鑒定出308種蛋白質，包括16對患者(急性期和rec期)，其中8對來自第1波(未接受地塞米松治療)和第2波(接受地塞米松治療)的COVID-19危重患者，外加第1波(未配對)的急性期患者樣本?；鹕綀D顯示，與rec期相比，急性期第1波中涉及組織保護的蛋白質，如SERPINA10、炎癥標志物CRP、LBP、TSKU、SAA2和S100A9以及髓系免疫細胞標志物CD14增加了兩倍以上(圖8A)。對于第2波，僅在FDR為0.25時觀察到蛋白強度的差異，與波1相比，急性期和rec期的蛋白強度差異要小得多，但SAA2和S100A9的水平也較高(圖8B)。此外，根據患者的病情(急性期vs rec期)，對波1和波2患者中蛋白質的顯著強度變化進行評估，結果顯示，與波2相比，波1中CD14、HPR、MNDA和幾種SERPINAs等蛋白質的倍數變化顯著更高(圖8C)，表明波1和波2中炎癥介質水平存在顯著差異。對于兩波患者受影響的不同途徑，他們通過Reactome (Reactome數據庫)基因集富集分析(GSEA)觀察到，與波1和波2之間的rec期相比，急性期的幾個代謝過程明顯失調(圖8D和8E)，特別是在先天免疫防御和細胞應激反應中。最后，他們進行了STRING相互作用分析：由于它們參與先天免疫反應、對細菌的防御反應、細胞因子的產生和髓系細胞的激活以及對感染的免疫效應反應的調節，大量已鑒定的蛋白質緊密相連(圖8G)。

圖8 COVID-19急性期患者血漿蛋白譜的評估及其相應的rec期

8、改善骨髓細胞對細菌挑戰的效應反應和降低炎癥介質水平與地塞米松治療有關

研究者使用健康供體中性粒細胞或單核細胞與第1波或第2波患者的血漿進行刺激試驗，并評估其對細菌挑戰的效應反應。結果顯示，與健康血漿刺激相比，波1血漿刺激的中性粒細胞細胞內細菌存活顯著增加(圖9A)， ROS水平降低(圖9B)，細胞死亡增強(圖9C)，而波2血漿刺激沒有觀察到這些差異。一項對第一波發生細菌重復感染的COVID-19患者的分析顯示，在急性期和rec期，通過細胞因子總結評分(炎癥指數)測量的累積細胞因子水平顯著升高(圖1D和9D)。此外，與第一波相比，在第二波中，菌血癥患者血漿中的細胞因子總結評分顯著降低(圖9E，左)，且在肺部重復感染患者中呈下降趨勢(圖9E，右)。

圖9 與第一波和第二波COVID-19相比，血漿中炎癥介質的定量及其與細菌重復感染的關系

02主要結論

研究者證明了在急性COVID-19期間，重癥患者出現了中性粒細胞和單核細胞效應細胞因子的改變，這嚴重影響了他們應對細菌挑戰的能力，這是通過對中性粒細胞和單核細胞進行深入的功能和表型評估確定的。這些數據證實了臨床病程，與第2波相比，第1波重癥COVID-19患者的細菌重復感染增加。他們的研究進一步強調了針對性治療的重要性，旨在恢復中性粒細胞和單核細胞的抗菌效應功能，從而降低COVID-19因繼發性細菌感染導致死亡率升高的風險。

審核編輯 ：李倩