如果從成像結(jié)果來(lái)考察一款科研相機(jī)，最重要的一般有3個(gè)特征：

（1）黑白還是彩色。彩色相機(jī)能帶來(lái)顏色信息，但靈敏度和分辨率都不及同參數(shù)的黑白相機(jī)。

（2）幀速。無(wú)論是高速移動(dòng)的樣品還是一閃而過(guò)的光信號(hào)，都需要高幀速相機(jī)才有可能采集到。

（3）成像質(zhì)量。影響成像質(zhì)量（或者經(jīng)常聽到"清晰度"這樣的口頭表述）的因素，包括信噪比和分辨率。無(wú)論是信噪比過(guò)低，還是分辨率過(guò)低，都無(wú)法得到讓人滿意的圖片（如圖1）。

圖1. 信噪比和分辨率對(duì)成像質(zhì)量的影

本文主要討論信噪比。

信噪比公式及解析

在相機(jī)的成像過(guò)程中，除了真實(shí)的信號(hào)，還會(huì)引入一系列的不確定性（光信號(hào)本身的不確定性、材料熱運(yùn)動(dòng)，電子學(xué)噪聲等等）——稱為噪聲。而信號(hào)與噪聲的比值被定義為信噪比（Signal-to-Noise Ratio, SNR）。

相機(jī)的信噪比可以通過(guò)如下公式計(jì)算得出：

圖2. 信噪比公式

公式中的分子部分就是"信號(hào)"，單位時(shí)間的入射光子數(shù)目（P，即信號(hào)的強(qiáng)度）乘以曝光時(shí)間（t），即為入射光子的總數(shù)目，其中有一定比例（QE，量子效率）被相機(jī)轉(zhuǎn)換為電荷，最終稱為相機(jī)成像的"信號(hào)"。

公式中的分母部分是"噪聲"，分成三個(gè)組成部分。

（1）第一個(gè)部分是來(lái)自"真實(shí)信號(hào)"的散粒噪聲——√P·QE·t. ( 如何理解這個(gè)"散粒噪聲"呢？比如原始的光信號(hào)對(duì)應(yīng)每秒鐘100個(gè)光子落到一個(gè)像素上，但實(shí)際的情況卻有可能是第一個(gè)一秒鐘，落下了97個(gè)光子；第二個(gè)一秒鐘落下了104個(gè)光子；第三個(gè)一秒鐘落下來(lái)101個(gè)光子；等等等等。這種不確定性就是散粒噪聲的來(lái)源。

（2）第二個(gè)部分是來(lái)自暗電流的散粒噪聲——√D·t.由于相機(jī)的芯片是Si（或者InGaAs等其他材料），只要不是絕對(duì)零度，電子的熱運(yùn)動(dòng)都會(huì)有幾率被當(dāng)成"信號(hào)"讀出——稱之為暗電流。暗電流可以隨著時(shí)間而積累。雖然暗電流是可能通過(guò)后期算法給扣除的，但是其不確定性，或者說(shuō)來(lái)自于暗電流的散粒噪聲卻無(wú)法消除。

（3）第三個(gè)部分是讀出噪聲——R。讀出噪聲的來(lái)源很多，實(shí)際操作中，將相機(jī)的蓋子關(guān)閉（即沒(méi)有任何光信號(hào)），采用最短的曝光時(shí)間（盡可能排除暗電流/暗噪聲的影響）所得到的圖像中的像素值的不確定性就被記為讀出噪聲。讀出噪聲是一個(gè)籠統(tǒng)但是很有實(shí)用性的概念——尤其在高速弱光成像中，因?yàn)榇藭r(shí)曝光時(shí)間很短，所以暗電流/暗噪聲都很小，主要的噪聲來(lái)源就是讀出噪聲。

由于以上三種噪聲來(lái)源互不相關(guān)，所以總噪聲就等于其平方和再取平方根。

對(duì)于特定的拍攝條件，讀出噪聲和暗電流都是固定的。所以信號(hào)越強(qiáng)，其散粒噪聲也越大，成為噪聲的主要來(lái)源。此時(shí)信噪比公式可以近似為：

圖3. 信號(hào)較強(qiáng)時(shí)的近似信噪比公式

但如果信號(hào)很弱，來(lái)自信號(hào)的散粒噪聲就很小，此時(shí)讀出噪聲和暗電流的影響就不能忽略。

那么，如果希望提升相機(jī)成像的信噪比，改善信號(hào)較弱時(shí)的成像質(zhì)量，我們能夠從上面的信噪比公式中得到怎樣的啟發(fā)呢？大致說(shuō)來(lái)有6個(gè)方面。

# 影響信噪比的因素（1）——曝光時(shí)間

無(wú)論是從大家日常的理解還是從信噪比公式中，我們都很容易得出曝光時(shí)間（t）越長(zhǎng)，信噪比越高的結(jié)論。

圖4. 曝光時(shí)間與信噪比的關(guān)系

然而，曝光時(shí)間長(zhǎng)了，幀速就無(wú)法得到保障。曝光時(shí)間為1 s的時(shí)候，無(wú)論如何幀速也是無(wú)法超過(guò)1幀/秒的。

所以，曝光時(shí)間的延長(zhǎng)能夠提升信噪比，但是會(huì)損失幀速。

# 影響信噪比的因素（2）——光學(xué)系統(tǒng)的素質(zhì)

對(duì)于同一樣品發(fā)出的信號(hào)，光學(xué)系統(tǒng)直接影響到落到相機(jī)上的光信號(hào)強(qiáng)度（即公式中的"P"）。對(duì)于顯微成像而言，最常見(jiàn)的的提升方式就是選擇更好的物鏡；一般而言，數(shù)值孔徑（NA）越大，物鏡對(duì)信號(hào)的收集能力越強(qiáng)。

圖5. 不同數(shù)值孔徑（NA）的物鏡對(duì)成像效果的影響。(a) Plan 20×/0.4 NA; (b) UPlanFL N 20×/0.5 NA; (c) UPlanSApo 20×/0.75 NA.（參考用圖，如若侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系刪除）

小結(jié)：用你能得到的最好的光學(xué)系統(tǒng)

# 影響信噪比的因素（3）——像素尺寸

像素尺寸也是影響信噪比公式中的"P"（入射的光子數(shù)目）；像素尺寸越大，落到一個(gè)像素上的光子就越多。在其他參數(shù)都一致的情況下，信噪比自然就越高。但過(guò)大的像素尺寸會(huì)損失相機(jī)的分辨率。

簡(jiǎn)而言之，在不調(diào)節(jié)光路僅僅更換相機(jī)的情況下（這是非常常見(jiàn)的場(chǎng)景），采用更大像素尺寸的相機(jī)在增加信噪比的同時(shí)往往會(huì)降低圖像的分辨率（如圖6）。

圖6. 不同像素尺寸相機(jī)對(duì)同一樣品的成像效果對(duì)比。樣品為直徑1μm的熒光小球，放大倍數(shù)60X

# 影響信噪比的因素（4）——制冷與暗電流

由于暗電流（信噪比公式中的"D"）來(lái)源于材料中電子的熱運(yùn)動(dòng)，所以芯片溫度越高，暗電流越大；對(duì)于同一芯片，近似的規(guī)律是溫度每下降10度，暗電流減小一半。

當(dāng)前市場(chǎng)上的中高端科研相機(jī)的暗電流通常都很小，在1 s以下曝光時(shí)間時(shí)，暗噪聲相比于讀出噪聲通常可以忽略。但由于暗電流隨曝光時(shí)間會(huì)積累，所以越是長(zhǎng)曝光時(shí)間的應(yīng)用，制冷就越重要。

在實(shí)際選型中，不同類型的相機(jī)對(duì)制冷的要求也不盡相同：

（1）對(duì)于EMCCD相機(jī)，像素尺寸通常較大（常見(jiàn)的為13-16 μm），每個(gè)像素上產(chǎn)生的暗電流本就較多，而且EMCCD中的暗電流還會(huì)和信號(hào)一起被增益放大，所以用制冷壓制EMCCD相機(jī)的暗電流產(chǎn)生尤其重要。因?yàn)檫@些原因，主流的EMCCD相機(jī)制冷溫度都在-50 ℃以下。

（2）而對(duì)于sCMOS相機(jī)，不僅像素尺寸會(huì)較小一些（常見(jiàn)的為6.5 μm），也沒(méi)有額外的增益，所以對(duì)制冷的要求就相對(duì)低一點(diǎn)。

從圖7中可以看到，在sCMOS相機(jī)中，制冷溫度的具體高低影響不是那么明顯，但有沒(méi)有制冷對(duì)暗噪聲的表現(xiàn)影響很大（圖7-A是沒(méi)有制冷的相機(jī)，圖7-B,C,D都是有制冷的）。這是因?yàn)椋坏](méi)有制冷，相機(jī)的芯片工作溫度并不是簡(jiǎn)單的室溫，而通常高達(dá)60-70 ℃，在長(zhǎng)時(shí)間曝光中（如圖7中的10 s曝光時(shí)間），其暗電流自然就會(huì)高到不可忽視。

筆者在平時(shí)工作中，就曾經(jīng)有過(guò)兩個(gè)有趣的相關(guān)經(jīng)歷。第一個(gè)是剛接觸科研相機(jī)時(shí)，看到許多諸如室溫下10 ℃（-10 ℃ from ambient temperature）的相機(jī)，表示不可理解，覺(jué)得"就10度的制冷，這有啥用？"。第二個(gè)是濱松有一款面向產(chǎn)業(yè)客戶的板級(jí)sCMOS相機(jī)C11440-62U，其制冷溫度為室溫上10 ℃（+10℃ from ambient temperature），剛看到參數(shù)的時(shí)候也是小小疑惑了一把。其實(shí)當(dāng)年產(chǎn)生這樣的疑惑，就是因?yàn)闆](méi)有意識(shí)到如果相機(jī)沒(méi)有制冷，實(shí)際的工作溫度將遠(yuǎn)超室溫這一點(diǎn)。

圖7. 冷卻對(duì)相機(jī)的影響。四張圖片來(lái)自于四臺(tái)相機(jī)，均采用10 s的曝光時(shí)間，LUT設(shè)置成一樣。這四臺(tái)相機(jī)采用了同樣的芯片，但制冷溫度不同。從左至右依次為：(a) 沒(méi)有制冷（C11440-52U）；(b) 制冷溫度為10 ℃（C11440-42U）；(c) 制冷溫度為-10 ℃（C11440-22CU，風(fēng)冷模式）；(d) 制冷溫度為-20 ℃（C11440-22CU，水冷模式）

小結(jié)：對(duì)于當(dāng)今的高端相機(jī)，只要有制冷，暗電流都很小。

# 影響信噪比的因素（5）——量子效率

量子效率（即信噪比中的QE）為光子在相機(jī)像素上轉(zhuǎn)換成為電子的比例。同樣是100個(gè)光子落到一個(gè)像素上，QE 82%意味著相機(jī)能夠轉(zhuǎn)換得到82個(gè)電子；QE 72%則代表能轉(zhuǎn)換得到72個(gè)電子。顯然，QE越高，相機(jī)的信噪比越高。

圖8. 量子效率對(duì)信噪比的影響

有關(guān)QE，看參數(shù)時(shí)需要特別注意以下兩點(diǎn)：

（1）QE與波長(zhǎng)是有關(guān)的，對(duì)于同一臺(tái)相機(jī)，不同波長(zhǎng)的QE并不相同。以ORCA-Flash 4.0 V3為例，在600nm的紅光處其QE為最高的82%，在900 nm的紅外光處就只剩下了25%左右。

（2）一般我們?cè)诟叨丝蒲邢鄼C(jī)的參數(shù)表中看到的都是量子效率峰值——也就是相機(jī)最靈敏的波長(zhǎng)所對(duì)應(yīng)的QE。但是，不同相機(jī)/芯片的量子效率峰值所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)并不一樣，所以如果確切的直到自己信號(hào)的波長(zhǎng)/顏色，最好能夠確認(rèn)下相機(jī)在對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)下的QE，而不是簡(jiǎn)單地比較量子效率峰值。

如圖9中左圖所示，ORCA-Spark的峰值波長(zhǎng)在450-500 nm之間，QE峰值為80%；而Flash 4.0 LT的峰值波長(zhǎng)在550-600 nm之間，QE峰值為72%。雖然ORCA-Spark的量子效率峰值更高，但如果針對(duì)紅色熒光，F(xiàn)lash 4.0 LT的QE反而更好。

小結(jié)：QE很重要，但QE峰值更多是個(gè)參考，查到關(guān)注波長(zhǎng)的QE值非常關(guān)鍵。

# 影響信噪比的因素（6）——讀出噪聲（R）

在信號(hào)較弱的成像中，來(lái)自信號(hào)的散粒噪聲較小；而暗電流的散粒噪聲（即暗噪聲）在當(dāng)前的高端科研相機(jī)都是很低的，在曝光時(shí)間1s這個(gè)量級(jí)甚至更短的時(shí)候，暗噪聲通常可以忽略；此時(shí)讀出噪聲（即信噪比公式中的"R"）就稱為特別需要考量的因素了。

對(duì)于同樣的芯片，讀出噪聲的大小與讀出速度有關(guān)，無(wú)論對(duì)于CCD相機(jī)還是sCMOS相機(jī)，讀出速度越快，讀出噪聲越高。而sCMOS相對(duì)于CCD的一個(gè)核心優(yōu)勢(shì)，就是高速讀出時(shí)依然能夠保持極低的讀出噪聲。

讀出噪聲的重要性也使得其和QE一起變成了相機(jī)被重點(diǎn)關(guān)注的兩個(gè)參數(shù)。單純考察兩者中的一個(gè)優(yōu)勢(shì)并不能正確預(yù)測(cè)成像的信噪比。如圖9所示，同樣拍一個(gè)綠色熒光樣品，QE較高的ORCA-Spark成像質(zhì)量卻不如ORCA-Flash 4.0 LT，就是因?yàn)镺RCA-Flash 4.0 LT的讀出噪聲較低，綜合考慮時(shí)ORCA-Flash 4.0 LT的信噪比更好。

圖9. 讀出噪聲對(duì)信噪比的影響

小結(jié)：如果用于弱信號(hào)探測(cè)，相機(jī)的讀出噪聲對(duì)于總體的信噪比很重要。

審核編輯黃宇