細(xì)胞通過限制性三維遷移可導(dǎo)致核包膜完整性喪失、DNA損傷和基因不穩(wěn)定。盡管有這些有害的現(xiàn)象，暫時暴露在封閉環(huán)境中的細(xì)胞通常不會死亡。目前，這是否也適用于受到長期禁錮的細(xì)胞仍不清楚。近日，來自美國奧本大學(xué)的Panagiotis Mistriotis教授團隊進行了通過下調(diào)YAP活性限制P53過度激活以促進細(xì)胞在封閉中存活的相關(guān)研究。研究成果以“Downregulation of YAP Activity Restricts P53 Hyperactivation to Promote Cell Survival in Confinement”為題發(fā)表在Advanced Science期刊上。

在該項研究中，研究人員采用了光刻和微流控技術(shù)制造一個高通量的器件，該器件規(guī)避以前細(xì)胞封閉模型的限制，并能在生理相關(guān)尺度的微通道中長期培養(yǎng)單細(xì)胞。這項研究的結(jié)果表明，連續(xù)暴露在嚴(yán)格的封閉環(huán)境中會引發(fā)頻繁的核包膜破裂，反過來又會促進P53的激活和細(xì)胞凋亡。遷移的細(xì)胞最終會適應(yīng)密閉，并通過下調(diào)YAP活性來逃避細(xì)胞死亡。YAP活性的降低是封閉誘導(dǎo)YAP1/2轉(zhuǎn)位到細(xì)胞質(zhì)的結(jié)果，抑制了核包膜破裂的發(fā)生率，并廢除P53介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。總之該研究建立了先進、高通量的生物模擬模型，以更好理解健康和疾病中的細(xì)胞行為，并強調(diào)環(huán)境線索和機械傳導(dǎo)途徑在調(diào)節(jié)細(xì)胞生命和死亡中的關(guān)鍵作用。

光刻和微流控技術(shù)在生理尺寸微通道中禁錮細(xì)胞

將微流控技術(shù)與光刻圖案化結(jié)合起來，從而能夠研究長期三維封閉如何影響細(xì)胞行為。研究人員首先建立了一個平行微通道陣列，其尺寸模仿體內(nèi)遷移細(xì)胞遇到的通道狀軌道或微血管的大小。與這些微通道垂直的是兩個較大的、類似于二維的通道，作為細(xì)胞和培養(yǎng)基的儲存器。通過應(yīng)用PRIMO光刻技術(shù)和光活化試劑PLPP，降解了襯在微通道壁上的防粘層，并使用ECM蛋白涂覆。接著將細(xì)胞引入微流控器件，在入口和出口之間產(chǎn)生一個壓力差，促使細(xì)胞流經(jīng)最下層的二維類通道。盡管細(xì)胞未能粘附在用PLL-mPEG-SVA處理的通道上，但它們卻附著在膠原蛋白I光刻圖案微通道的入口附近。在趨化作用下，細(xì)胞進入用光刻的微通道。接下來，研究人員量化了細(xì)胞進入后留在微通道內(nèi)的細(xì)胞比例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在光刻圖案微通道中的夾帶效率達到80% ~ 95%，并且與幾何形狀無關(guān)。相比之下，膠原蛋白I涂層的器件，有利于細(xì)胞通過微通道遷移。總之，將微流控技術(shù)與光刻技術(shù)相結(jié)合，可以開發(fā)出一種平臺技術(shù)，實現(xiàn)在規(guī)定尺寸微通道中對單細(xì)胞進行長期培養(yǎng)。

圖1 利用光刻技術(shù)在微通道壁上沉積ECM

封閉環(huán)境中的細(xì)胞分裂和死亡

接下來，對部分、全部和橫向封閉的微通道內(nèi)的細(xì)胞分裂和存活率進行量化。作為二維對照，采用橫截面積為400μm × 50 μm的膠原蛋白I涂層通道。在封閉的微環(huán)境中，相對于二維對照，18小時內(nèi)分裂的細(xì)胞比例減少。在細(xì)胞禁錮的后期細(xì)胞增殖減少。同時，大多數(shù)未分裂的細(xì)胞在封閉60小時后顯示其縱向面積增加。雖然細(xì)胞在非封閉和部分封閉微環(huán)境中保持較高的活力，但垂直而非橫向的封閉會誘發(fā)細(xì)胞死亡。通過監(jiān)測與FITC共軛的牛血清白蛋白（BSA）的擴散，驗證了垂直封閉的細(xì)胞可以獲得營養(yǎng)物質(zhì)。表明細(xì)胞系之間對封閉誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的敏感性是不同的。為了將本文研究結(jié)果從基于PDMS的微機制擴展到更易受外界影響的生物環(huán)境，使用具有不同硬度和孔徑的三維膠原蛋白水凝膠基質(zhì)。將HT-1080纖維肉瘤細(xì)胞包裹在柔軟的、平均孔徑1.5 μm的水凝膠中，在3天的培養(yǎng)中支持細(xì)胞增殖、擴散和生存。相反，僵硬的水凝膠與減少的孔徑損害了細(xì)胞伸長，阻礙了細(xì)胞生長，并促進細(xì)胞死亡。這些發(fā)現(xiàn)表明，細(xì)胞死亡可能發(fā)生在具有生理學(xué)相關(guān)力學(xué)的封閉微環(huán)境中。

圖2 三維封閉調(diào)控細(xì)胞分裂和細(xì)胞死亡

垂直封閉中P53激活引發(fā)細(xì)胞凋亡

為了確定封閉促進細(xì)胞死亡的機制，該研究分析了部分和垂直封閉微通道中皮膚成纖維細(xì)胞或HT-1080細(xì)胞表型。垂直封閉成纖維細(xì)胞在禁錮1或3天后有60%的膜出血。在垂直封閉的HT-1080細(xì)胞中，膜出血的程度更加明顯。在禁錮一天后，80%的細(xì)胞顯示出血的表型。在部分封閉的微通道中，無論細(xì)胞類型如何，都沒有膜出血現(xiàn)象。用熒光延時監(jiān)測HT-1080細(xì)胞表達肌動蛋白和組蛋白2B情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)碎裂細(xì)胞核的百分比隨著時間的推移而增加，18小時后達到20%。大多數(shù)垂直封閉的細(xì)胞在細(xì)胞死亡期間增加了caspase-3/7的活性。相反，保持活力的垂直封閉細(xì)胞或部分封閉的細(xì)胞未能激活這些蛋白酶。這些數(shù)據(jù)顯示，垂直封閉主要通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來保證細(xì)胞的活力。當(dāng)核包膜完整性受到損害時，會滲漏到細(xì)胞質(zhì)中。與存活的細(xì)胞相比，最終死亡的夾層細(xì)胞中NERs的嚴(yán)重程度更為明顯。相反，在支持細(xì)胞存活的部分或橫向封閉的微通道中，NER的頻率和經(jīng)歷NER細(xì)胞的比例明顯減少。總的來說，這些發(fā)現(xiàn)表明，垂直封閉促進了核包膜完整性的頻繁喪失，反過來又誘導(dǎo)了P53依賴的DNA損傷反應(yīng)，從而使細(xì)胞凋亡。

圖3 垂直封閉中P53激活引發(fā)細(xì)胞凋亡

YAP進入細(xì)胞質(zhì)通過降低NER和P53活性發(fā)生率促進細(xì)胞對封閉環(huán)境適應(yīng)

圖4 封閉誘導(dǎo)的YAP進入細(xì)胞質(zhì)中，降低YAP的活性

一部分成纖維細(xì)胞和HT-1080細(xì)胞能夠適應(yīng)垂直封閉并存活。此外P53活性在第3天有所下降，這表明存在一種機制來限制P53依賴的促凋亡途徑激活。使用免疫熒光法，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞進入垂直而非部分封閉的微通道后，機械傳導(dǎo)因子YAP1立即轉(zhuǎn)入HT-1080細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。禁錮24小時后，還觀察到Y(jié)AP1的細(xì)胞質(zhì)定位增加。YAP1和YAP2可以通過與TEAD轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)聯(lián)來調(diào)節(jié)基因表達。因此，將YAP/TEAD-RE（ACATTCCA）亞克隆到LVDP載體，以量化YAP的轉(zhuǎn)錄活性。YAP轉(zhuǎn)錄活性的量化顯示，在細(xì)胞進入微通道后24小時，相對于部分封閉的成纖維細(xì)胞，垂直封閉的成纖維細(xì)胞顯示出YAP依賴的基因表達減少。在攜帶突變體P53基因的MDA-MB-231細(xì)胞中也有類似的減少，表明P53沒有介導(dǎo)觀察到的YAP活性下降。接下來研究了禁閉如何改變YAP的亞細(xì)胞分布。使用Exportin 1抑制劑處理部分和垂直封閉的細(xì)胞。核包膜破裂參與觸發(fā)YAP轉(zhuǎn)位到細(xì)胞質(zhì)，抑制NER的側(cè)向封閉將促進YAP的核累積。這些數(shù)據(jù)表明，RhoA/ROCK途徑控制YAP核上質(zhì)運輸，與NER無關(guān)，可能是通過抑制Exportin 1介導(dǎo)的YAP1核出口。

圖5 細(xì)胞質(zhì)中YAP積累支持細(xì)胞在封閉狀態(tài)下的存活

以上研究表明YAP到細(xì)胞質(zhì)出口可以由活躍的核出口機制調(diào)節(jié)，而不是由NER調(diào)節(jié)。YAP的構(gòu)成性激活已證明會損害核膜的完整性。這些發(fā)現(xiàn)促使研究人員假設(shè)，禁閉誘導(dǎo)YAP進入細(xì)胞質(zhì)中，抑制YAP依賴的轉(zhuǎn)錄活動，最終減少了NER、P53活性和細(xì)胞死亡的頻率。與這一假設(shè)一致，該研究證明垂直封閉的HT-1080細(xì)胞仍然存活，相對于那些死亡的細(xì)胞，EGFP-YAP2的核水平降低。此外，該研究發(fā)現(xiàn)用siYAP1處理的垂直封閉的HT-1080細(xì)胞的細(xì)胞核相對于對照細(xì)胞的細(xì)胞核破裂頻率較低。YAP1敲除也抑制發(fā)生NER成纖維細(xì)胞的比例，并減少了P53的激活。這種干預(yù)促進兩種細(xì)胞類型在垂直封閉中的生存能力。相反，用針對LATS2的siRNA轉(zhuǎn)染HT-1080細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞，使YAP磷酸化和失活，明顯增加YAP1的核水平，并加劇封閉誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。總而言之，該研究數(shù)據(jù)表明，YAP活性的下調(diào)有助于細(xì)胞對封閉適應(yīng)，從而使細(xì)胞存活。

綜上所述，該研究利用微流控實驗和成像工具，證明了封閉的幾何形狀和等級控制著遷移細(xì)胞的生長和生存。在封閉微環(huán)境中，腫瘤抑制因子P53是控制細(xì)胞存活和死亡的關(guān)鍵因素。YAP在調(diào)節(jié)NER和P53活性中具有關(guān)鍵作用，介導(dǎo)細(xì)胞對封閉環(huán)境的適應(yīng)。該研究對癌癥治療有更廣泛的意義，因為它產(chǎn)生了關(guān)于遷移腫瘤細(xì)胞如何感知和應(yīng)對長期三維封閉的新理念。已有研究表明，循環(huán)腫瘤細(xì)胞被困在封閉微血管中與細(xì)胞活力的降低有關(guān)。因此，制定策略以提高細(xì)胞對封閉反應(yīng)能力可能是抑制血管內(nèi)腫瘤細(xì)胞生存的一種新方法。

審核編輯：劉清