圖1：本文基于Feng et al., 2022, NIR-II Multifocal Structured Illumination Microscopy

光學顯微鏡是人類研究各種生物學問題不可或缺的強大手段。然而，生物組織的復雜組成和異質性帶來了嚴峻的挑戰——光線在傳播過程中會被生物質散射，嚴重影響最終獲得的空間分辨率和穿透深度。

傳統熒光成像技術一般基于可見光(VIS:400–700 nm)和近紅外一區(NIR-I:700–1000 nm)這兩個窗口。近年來，受益于波長更長的光子在生物組織內傳播時散射率更低、近紅外二區(NIR-II:1000 1700nm)自體熒光背景更弱等優點，基于NIR-II的熒光成像技術引起了科研人員的廣泛興趣。

在NIR-II區，科研人員可以獲得更深的生物組織穿深和更低的背景噪音;另一方面，基于InGaAs傳感器的高效短波紅外(SWIR)相機的不斷進步也極大地促進了NIR-II成像技術的廣泛應用。

受NIR-II成像優點的啟發，科研人員又開發了幾類在NIR-Ⅱ區域發射的熒光探針以及技術，推動了NIR-II成像技術的進步。

創新方案

在這份工作中，科研及研發人員通過將多焦點結構照明顯微技術(MSIM)集成到NIR-II熒光顯微技術中，首次實現了NIR-II MSIM。該系統在高散射介質2.5mm深度處的空間分辨率達到近1.49μm。

多焦點照明模式是通過聚焦一束相位調制的高斯光束生成的，其波前由加載有計算機生成全息圖(CGH)的相位空間光調制器(SLM)整形。系統整體結構示意圖請見圖2。

圖2：NIR-II MSIM系統及原理示意圖(a)NIR-II MSIM示意圖。BE：擴束器;HWP：半波片;PBS：偏振光分離器;M1-2：反射鏡;RL1–4：中繼透鏡;RM：矩形遮罩;DM：分色鏡;OBJ，物鏡;MS：移動臺;LPF，長通濾波器，TL，管透鏡。插圖顯示CGH 在SLM平面上的輪廓(左)和在OBJ焦平面的模擬多焦圖案(右)。(b)NIR-II染料的吸收和光致發光產生的發射。(c)12×12多焦照明模式實驗結果。上邊界和右邊界對應于沿兩個正交方向的最大強度投影(MIP)方向。這里，面板(a)和(c)中的ξ和η對應目標焦平面上的笛卡爾坐標。(d)單個NIR-II染料顆粒的NIR-II WF圖像(上部插圖)和NIR-II MSIM圖像(下部插圖)的歸一化橫截面輪廓(點)和高斯擬合(線)。

通過用波長為850nm的激光激發明亮的NIR-II熒光團，該系統可以在0–2.5mm的成像深度范圍內以增強的空間分辨率和對比度完成圖像重建。見圖3以及圖4。

圖3：NIR-II MSIM系統增強分辨率示意圖。(a)、(b)分別為分散的NIR-II染料的NIR-II WF圖像和NIR-Ⅱ MSIM圖像。下圖為圖中方框部分的放大結果。(c)沿(a)和(b)下圖中所示彩色虛線的歸一化強度示意圖。(d)兩個插圖的徑向平均強度分布，為(a)、(b)上圖二維傅里葉變換的結果。

圖4：不同光譜窗口的NIR-II MSIM成像。圖像分別為通過截止波長為(a)1000nm的濾光片;(b)1300nm的濾光片的結果。(c) –(e)(a)和(b)中所示虛線的歸一化強度分布。

在更長的發射波長下獲得的結果也顯示出優越的性能。

該工作證明了NIR-II MSIM是一種強大的生物成像觀測方法，可以提供深度穿透能力以及增強的空間分辨率和對比度。在未來，將會有更多應用于活體成像領域和跨學科研究的機會。

TPI 產品

圖5：本工作中所用到的特勵達普林斯頓儀器產品 NIRvana-HS

本工作中的科研與研發人員在采集信號時使用了來自特勵達普林斯頓儀器的NIRvana-HS近紅外相機。該相機基于InGaAs芯片開發，采用全金屬密封的真空腔、先進的深度制冷技術和強大的噪聲抑制算法，確保科研人員獲得出色的數據。NIRvana-HS為NIRvana家族中幀速最高的產品。如果您的實驗需要高幀速紅外相機，NIRvana-HS將是您的不二之選。

審核編輯 黃宇