★歡迎引用:

Yang, H., Huang, W., Chu, S., Zhang, X., & Wang,X. (2024). In situ assessment of stress level in perch during cryogenicwaterless live transportation using multisource impedance electrodes. Sensorsand Actuators A: Physical, 115083.

★研究背景

傳統(tǒng)的活魚應(yīng)激水平判定基于生化指標測試方法，例如血糖，皮質(zhì)醇等，面臨著費時費力的困境。為此，中國農(nóng)業(yè)大學王想副教授、張小栓教授團隊開發(fā)了基于三種材質(zhì)和四種形狀的阻抗電極以及后端的阻抗測量系統(tǒng)，用于無水低溫環(huán)境下鱸魚的應(yīng)激水平監(jiān)測。試驗旨在比較電極的不同材質(zhì)和形狀對測量結(jié)果的影響和通過測量肌肉收縮變化來準確評估魚類的應(yīng)激狀態(tài)。結(jié)果表明，片狀同側(cè)，銅材質(zhì)的電極是監(jiān)測鱸魚應(yīng)激水平的最佳電極，通過數(shù)據(jù)挖掘和形態(tài)學特征提取方法將12h內(nèi)鱸魚的應(yīng)激水平分為急性應(yīng)激，體內(nèi)調(diào)節(jié)，適應(yīng)應(yīng)激，累積應(yīng)激和瀕死五個階段，該結(jié)果與標準的血糖數(shù)據(jù)相匹配。基于ANN模型的應(yīng)激水平預(yù)測模型取得了高達91.66%的預(yù)測精度，證明了系統(tǒng)的有效性。這項研究有利于提高活魚運輸過程中的健康管理水平，為推動智慧漁業(yè)的發(fā)展邁出了一步。

★ 文章解析

以鱸魚為例，本研究探討了使用阻抗譜法判定鱸魚應(yīng)激水平的可行性，還重點關(guān)注了不同阻抗電極對鱸魚應(yīng)激水平的預(yù)測效果，圖1展示了本文的研究框架。我們提出了一種創(chuàng)新的方法來評估魚類的壓力水平，包括比較電極屬性和通過測量肌肉收縮變化來準確評估魚類的應(yīng)激狀態(tài)。根據(jù)壓力水平評估結(jié)果，我們將鱸魚分為不同的應(yīng)激等級，以便針對不同等級的魚類制定相應(yīng)的調(diào)控措施。此外，壓力水平評估還可以幫助監(jiān)測鱸魚在不同環(huán)境和運輸條件下的應(yīng)激反應(yīng)。基于機器學習算法的應(yīng)激水平預(yù)測模型取得了高達95.16%的預(yù)測精度，隨著時間的增長，活魚的應(yīng)激水平不斷增加，與實際的血糖數(shù)據(jù)相匹配。這項工作有利于準確把握活魚運輸過程中的應(yīng)激狀態(tài)，從而為相關(guān)人員提供決策依據(jù)。

圖1：框架圖

鮮活的鱸魚從北京市圣熙八號市場直接購買，然后立即有水充氧運輸至國家食品質(zhì)量安全北京實驗室。所有的魚體均是健康無損傷的，經(jīng)過禁食1.5天后，對魚體進行降溫處理，速率控制在3℃/h，此步的目的是誘導鱸魚進行最佳的休眠溫區(qū)。然后立即放入無水保活包裝袋中，試驗溫度保持在4℃左右。試驗分為兩個批次進行。

試驗1：確定最優(yōu)的電極材料和電極形狀。針對三種材料的五種貼附方式，取15條鱸魚對15種電極進行尋優(yōu)試驗。具體體現(xiàn)在，針對鱸魚從健康到瀕死的過程，使用試驗電極對魚的兩種狀態(tài)進行阻抗譜測量。默認實驗開始時鱸魚的生命健康特征最為明顯。默認鱸魚的呼吸頻率首次為0的狀態(tài)為其瀕死狀態(tài)。記錄鱸魚從健康到瀕死的持續(xù)時間。

試驗2：進行最優(yōu)電極的持續(xù)監(jiān)測試驗和生化指標測試試驗。試驗2分為兩組，第一組根據(jù)試驗1中篩選中的最優(yōu)電極，選擇10條鱸魚進行長期的健康監(jiān)測試驗，旨在采集鱸魚生理阻抗信號的變化規(guī)律，阻抗信號采集頻率定義為10min/次。試驗時間根據(jù)試驗1中鱸魚從健康到瀕死的持續(xù)時間決定。第二組，每隔1h進行鱸魚血糖濃度的采集，并觀察鱸魚的呼吸頻率變化。該步驟旨在反映鱸魚在試驗過程中的真實應(yīng)激水平。

圖2：試驗圖

在選擇最優(yōu)電極時，分別對鱸魚的初始狀態(tài)和瀕死狀態(tài)進行阻抗譜測量。（默認初始狀態(tài)為肌肉收縮，瀕死狀態(tài)為肌肉舒張）結(jié)果如圖3所示。電極帶的長而窄的電極表面適合于大面積魚肉樣品的測量，能夠更好地與樣品接觸，但使用電極帶測量時需環(huán)繞魚體，操作較為繁瑣。測得的數(shù)據(jù)中，模值數(shù)據(jù)相差不大，相角數(shù)據(jù)只有銅電極區(qū)分較為明顯，如圖3a所示。圓環(huán)電極測量位置為軀干中間較為平坦的地方，有利于增加電極與魚體的接觸面積。測得的數(shù)據(jù)中，模值數(shù)據(jù)幾乎相同，銅電極和不銹鋼電極的相角數(shù)據(jù)有一定的區(qū)分，如圖3b所示。但實際操作中發(fā)現(xiàn)，該結(jié)構(gòu)的電極限制了測量對象在中心區(qū)域的濕潤程度，可能影響在該區(qū)域內(nèi)阻抗測量結(jié)果的重復性。片狀電極測量位置選擇在魚背鰭和軀干相交的位置，為防止測量時片狀電極的偏移現(xiàn)象，將無塵布潤濕后搭配片狀電極緊緊貼附在魚體表面。

片狀電極有同側(cè)排列和異側(cè)排列兩種數(shù)據(jù)收集方式，如圖3c-d所示。測量的相角數(shù)據(jù)無論低頻和高頻都很順滑，沒有明顯的毛刺，同側(cè)電極的測量結(jié)果由于異側(cè)電極，對鱸魚不同的狀態(tài)有著非常明顯的區(qū)分。針狀電極具有尖銳的幾何形狀，能夠集中電場，提供較高的局部電場強度。如圖3e所示，針狀電極相比與上述結(jié)構(gòu)的電極，它插入了魚體的內(nèi)部。數(shù)據(jù)整體較為順滑，沒有明顯的鋸齒和毛刺，數(shù)據(jù)質(zhì)量較為不錯，對鱸魚不同的狀態(tài)有著明顯的區(qū)分。材料方面，可以明顯看出不同材料在同一電極形狀下趨勢基本相同，所以在材料對測量結(jié)果的影響不大。

銀具有最佳的電導率，但是，銀電極成本較高，且易受環(huán)境影響，同時，銀也對魚體具有一定的毒性。不銹鋼的電荷傳遞效率較低，且易發(fā)生腐蝕現(xiàn)象，從而影響到實驗結(jié)果的準確性。相比之下，銅電極因其較高的電導率能夠?qū)崿F(xiàn)與魚體之間更高效的電學信號傳遞。同時，銅相比銀和不銹鋼而言更加耐用，能夠有效降低試驗的成本。因此，選擇銅電極作為后續(xù)試驗的電極。綜上所述，銅材料的片狀電極和針狀電極的效果較為優(yōu)秀，選擇這兩種電極進行下一步研究。同時片狀和針狀分別為無損接觸式和有損插入式，是兩種不同類型的電極。

圖 3：測量數(shù)據(jù)

相比于阻抗譜的模值曲線，相角曲線擁有更為豐富的圖像信息，從細胞層面來分析也該是如此。圖4a-c展示了鱸魚在無水低溫環(huán)境下的細胞電流路徑變化。其中，具有導電特性的胞外液和胞內(nèi)液可等效為電阻，具有絕緣特性的細胞膜可等效為電容。根據(jù)電路理論，被細胞膜阻斷的低頻電流只能通過細胞外液（圖4a）。但高頻電流能夠穿過細胞膜同時經(jīng)過細胞外液和與細胞內(nèi)液（圖4b）。細胞膜上存在多種離子通道，當這些通道受到適當?shù)拇碳せ蛘{(diào)節(jié)時，離子通道會開放，允許特定離子通過。這些離子的運動也會形成電流（圖4c）。電流流經(jīng)路徑的不同在模值曲線上只能反應(yīng)為數(shù)值大小的變化，但在相角曲線上，由于呈容性的細胞膜的狀態(tài)的變化，導致其會發(fā)生大小以及曲線彎曲度的變化，所以相角頻率曲線包含的信息更多，因此使用相位角數(shù)據(jù)進行下一步的分析。

細胞膜上存在多種離子通道，當這些通道受到適當?shù)拇碳せ蛘{(diào)節(jié)時，離子通道會開放，允許特定離子通過。這些離子的運動會形成電流，在細胞膜上產(chǎn)生電位變化，從而導致細胞膜的導電性增強。圖4d-e分別展示了片狀電極和針狀電極的相位角測量結(jié)果。對阻抗譜曲線進行了特征的提取，圖中的曲線呈“S”形分布，緊密分布，相互交叉。為了更好地研究這一區(qū)域，以針狀電極為例，將圖4e的紅框區(qū)域放大，可明顯的觀察到不同時間下相角曲線的交叉(圖4f)，這證明了區(qū)域內(nèi)的相角斜率隨時間變化，這里將其考慮為表示鱸魚應(yīng)激水平的形態(tài)學特征參數(shù)。在實際應(yīng)用中，由于近似直線上相鄰兩點的斜率相差不大，因此在計算直線斜率時，自動定位直線端點比較復雜。但曲線的峰谷點總是唯一的。因此，用峰谷點代替直線端點來計算鱸魚應(yīng)激水平的形態(tài)特征參數(shù)如圖4g所示。

片狀電極和針狀電極在不同頻率下的形態(tài)特征參數(shù)（相角斜率）分別如圖4h和圖4i所示。片狀電極由于貼附在魚體上，其形態(tài)特征參數(shù)曲線相較于插入式的針狀電極有些許鋸齒。但總體來說兩個形態(tài)特征參數(shù)曲線的趨勢大致上是相同的，先上升，然后經(jīng)歷一段平穩(wěn)期，接著下降，之后又是上升，最后再單調(diào)下降。且兩個曲線的極值點出現(xiàn)的次數(shù)也較為一致。兩個曲線均能分辨出魚的不同階段，但在電極選優(yōu)的試驗中，我們觀察到作為插入式的針狀電極的測試對象的魚，相比于無損的貼附在魚體表面的片狀電極其進入瀕死狀態(tài)的時間要快，也就是說插入式的針狀電極雖然數(shù)據(jù)較為穩(wěn)定，固定性較好，但是其會影響鱸魚的存活時間，因此我們最終選擇無損的片狀電極作為最優(yōu)電極。

圖 4：電極原理

為準確地識別鱸魚應(yīng)激水平的模式，我們分析了整個過程中血糖濃度和呼吸頻率的變化，如圖5a所示。在最初的3小時內(nèi)，鱸魚的血糖水平急劇下降。這種下降可能是魚類對低溫環(huán)境的反應(yīng)，它們將體內(nèi)儲存的糖原轉(zhuǎn)化為葡萄糖以對抗寒冷，導致血糖濃度降低。在3-5小時的時間段內(nèi)，鱸魚適應(yīng)了低溫環(huán)境，其代謝能力部分恢復，并導致血糖濃度反彈。在5-8小時內(nèi)，隨著鱸魚適應(yīng)環(huán)境，出現(xiàn)了輕微的應(yīng)激反應(yīng)，在這個反應(yīng)過程中，細胞消耗葡萄糖生成ATP，導致血糖濃度短暫下降。在這種下降后，胰高血糖素的釋放增加，促進肝糖原的分解和非葡萄糖物質(zhì)轉(zhuǎn)化為葡萄糖，最終提高了血糖水平。8小時后，魚類經(jīng)歷了應(yīng)激階段，肌肉收縮減少，活動水平下降。隨著魚類接近死亡，心臟功能惡化，導致血糖水平進一步下降。

呼吸頻率曲線表現(xiàn)出兩個明顯的趨勢：上升和下降。在最初的3小時內(nèi)，由于魚類處于無水環(huán)境中，呼吸頻率增加，以更快地獲取氧氣。在3-7小時內(nèi)，由于對低溫環(huán)境適應(yīng)，呼吸頻率逐漸降低。在7-8小時的時間段內(nèi)，呼吸頻率略微增加，可能是由于氧氣耗盡、呼出氣體積累和長時間暴露在無水環(huán)境中的原因。8小時后，隨著氧氣進一步消耗，魚類繼續(xù)在無水低溫環(huán)境中持續(xù)存在，呼吸頻率開始上升。在沒有水和寒冷的環(huán)境下，魚類逐漸失去活力，呼吸頻率持續(xù)下降。結(jié)合在3.2.1節(jié)中分析的電極斜率曲線，可以將鱸魚應(yīng)激特征的變化劃分為五個明顯的階段（圖5b）。階段一：（0~3h）急性應(yīng)激階段。個體進入無水低溫的新環(huán)境后產(chǎn)生了較為劇烈的生理應(yīng)激反應(yīng)。此時魚體增加了呼吸頻率和呼吸強度來維持正常的需氧量。階段二：（3~5h）體內(nèi)調(diào)節(jié)階段。隨著個體對新環(huán)境運輸脅迫的逐漸適應(yīng)，機體生理應(yīng)激反應(yīng)逐漸趨向平穩(wěn)。階段三：（5~6h）適應(yīng)應(yīng)激階段。在10h適應(yīng)了環(huán)境的鱸魚產(chǎn)生些許應(yīng)激反應(yīng)，身體出現(xiàn)些許應(yīng)激的擺動。階段四：（6~8h）累積應(yīng)激階段。進入應(yīng)激期尾聲，鱸魚已經(jīng)完全適應(yīng)了運輸環(huán)境，因此其生理指標逐漸穩(wěn)定，也意味著魚體處于深度休眠的狀態(tài)。階段五：（8~12h）瀕死階段。鱸魚度過應(yīng)激期，肌肉不再頻繁收縮，其活動能力下降。同時呼吸困難，代謝率急劇下降。

圖 5：應(yīng)激性能

將阻抗幅值，阻抗相位角輸入ANN模型，圖6的子圖左軸顯示了模型的預(yù)測結(jié)果。預(yù)測數(shù)據(jù)集由A1-A5樣本等距提取，目的是廣泛測試不同節(jié)點的數(shù)據(jù)。圖6a顯示了綜合因素影響下應(yīng)激水平的預(yù)測結(jié)果，其具有鮮明的層次感，絕大部分預(yù)測等級均在真實值附近，只有少數(shù)數(shù)據(jù)點偏離整數(shù)值。圖6b和c分別顯示了以阻抗原始參數(shù)為輸入和以形態(tài)學特征參數(shù)為輸入的應(yīng)激水平的預(yù)測結(jié)果，同樣具有鮮明的層次感，大部分預(yù)測等級均在真實值附近，但偏離整數(shù)值的數(shù)據(jù)點數(shù)明顯增多。值得一提的是，預(yù)測等級隨著時間的增長呈逐漸增加的趨勢，此時魚感到越來越不舒服，并可能增加運輸應(yīng)激的概率或程度。

其中，鱸魚在 0-3h 和6.5-8h的運輸階段內(nèi)，應(yīng)激水平變化幅度較大，受到外界環(huán)境脅迫的影響最明顯，結(jié)合應(yīng)激變化規(guī)律，應(yīng)更多的在此階段對魚體應(yīng)激水平進行干預(yù)及調(diào)節(jié)，以降低應(yīng)激過激對魚體質(zhì)量的影響。結(jié)合應(yīng)激水平的變化趨勢可知，由于應(yīng)激水平的累積作用，導致鱸魚的阻抗特性在較高的運輸脅迫下會隨應(yīng)激水平的升高而逐漸降低，應(yīng)控制運輸時間在8-10小時之內(nèi)。模型的誤差在圖6的子圖右軸顯示。三種條件下數(shù)據(jù)的預(yù)測誤差都接近零值線，說明模型具有較強的泛化能力。特別的，當絕對誤差在0.3以內(nèi)時，考慮綜合因子作用的預(yù)測精確度高達95.98%，高于單一環(huán)境因子預(yù)測模型（94.71%）和生理因子預(yù)測模型（95.02%）。但同時，仍有4組數(shù)據(jù)的預(yù)測誤差在1個等級以上，說明模型仍有待改進，但對整體預(yù)測精度影響不大。此外，預(yù)測集的預(yù)測精度與驗證集的預(yù)測精度較為接近，表明模型的適應(yīng)能力較強。該評價模型為活魚的應(yīng)激水平評價提供了參考。

圖 6：預(yù)測性能

★ 結(jié)論與展望

基于阻抗測量和數(shù)學建模方法，本文主要分析了無水低溫環(huán)境下鱸魚阻抗信息與鱸魚應(yīng)激水平的關(guān)系，提出了鱸魚應(yīng)激水平的預(yù)測方法。結(jié)果表明，片狀同側(cè)和銅材質(zhì)的阻抗電極是持續(xù)監(jiān)測鱸魚生理阻抗信息的最佳電極，基于ANN的應(yīng)激水平預(yù)測模型的精度高達93.98%，因此，它被認為適合實際應(yīng)用。試驗表明，隨著運輸時間的增長，鱸魚的應(yīng)激水平持續(xù)升高，最后直至瀕死甚至死亡。試驗過程中，應(yīng)更多的在在 0-3h 和6.5-8h的運輸階段內(nèi)對魚體應(yīng)激水平進行干預(yù)及調(diào)節(jié)，由于應(yīng)激水平的累積作用，應(yīng)控制運輸時間在8-10小時之內(nèi)。未來的工作可以研究提高輸入/輸出信息量對模型結(jié)果的影響，例如增加電極數(shù)量和降低掃頻間隔，推動阻抗檢測技術(shù)的發(fā)展與實際應(yīng)用。此外，將致力于提升預(yù)測模型的精度和穩(wěn)定性，以更好的控制和降低因應(yīng)激而死亡的概率。

審核編輯：黃飛