多光子成像技術是一種光學成像技術，其核心在于利用光子在樣品內產生的非線性光學效應，實現高分辨率的三維成像。

在多光子激發成像過程中，激光光束作用于樣品，通過雙光子或多光子吸收，產生非共振熒光或次諧波。這種非線性光學效應使得多光子顯微鏡具有比傳統顯微鏡更高的空間分辨率和深度分辨率。

在實際應用中，多光子顯微鏡在生物學、醫學、納米科學、材料科學等許多領域都有廣泛的應用。例如，它可以用于對生命科學領域的細胞和生物分子進行研究，通過組織的深度成像、減少細胞萎縮等優點，極大地促進了醫學、生物學等學科的發展。

多光子成像技術原理及特點

多光子激發是指在具有高光子密度的入射光激發下，處于基態的分子/原子同時吸收多個光子后躍遷到激發態，經過弛豫過程躍遷到亞穩態，最后自發輻射回到基態，釋放出頻率略小于多倍入射光頻率的熒光光子。

圖一 2PEF、3PEF過程能級示意圖

由于整個過程中存在非輻射的能量損失，激光光子的能量總是會大于激發光光子的能量，也就熒光的波長會小于激光的波長。在雙光子吸收過程中，熒光分子吸收兩個能量較低（波長較長）的光子到達激發態，并在躍遷回到基態時產生熒光，可用于熒光成像。

但也不是任意兩個光子就可以激發同一個熒光分子的，熒光分子在吸收了第一個激發光子后，等待吸收第二個光子的中間態只能維持幾十飛秒，這要求激發光束中相鄰兩個光子的間隔必須小到幾十飛秒內才能確保發生雙光子熒光激發現象產生，通過雙光子吸收截面公式δ=hνβ/（NAd0×10-3 ），可以得到一個大概值，也就是100GM（10-50cm-s/photon）。

相較于單光子激發熒光、激光掃描共聚焦和寬場成像等技術，多光子成像技術具有以下優點：

01多光子成像技術通常采用的激發光為波長較長的近紅外光，相比可見光，近紅外光在生物組織中的穿透能力更強，能夠觀察到生物組織中更深層的信息，侵入性較低；

02多光子成像只有在激發光焦點附近的區域才能激發熒光（如圖二），因此多光子成像技術具有天然的光學層析能力，能更好地對生物組織進行三成像；

03多光子成像在樣品的非焦點區域不產生熒光，能自動抑制離焦信號，因而相比寬場成像技術，多光子成像能實現近乎衍射極限的空間分辨率，因此能觀察到組織內更細微的結構；

04與共聚焦成像技術相比，多光子成像技術不需要使用針孔濾波，熒光收集效率高。

此外，多焦點多光子顯微技術（MMM）相較于單點掃描多光子顯微技術，具有更高的光能利用率和成像速度。它利用多個激發光點并行激發樣品并同時探測熒光信號，實現樣品的三維快速多光子激發熒光顯微成像。這種技術具有對活體樣品損傷小、成像深度大、圖像信噪比高等優點，因此成為在分子和細胞水平上進行生物醫學研究的重要手段。

審核編輯：黃飛