熒光分光光度計(jì)概要

　　熒光分光光度計(jì)是用于掃描液相熒光標(biāo)記物所發(fā)出的熒光光譜的一種儀器。其能提供包括激發(fā)光譜、發(fā)射光譜以及熒光強(qiáng)度、量子產(chǎn)率、熒光壽命、熒光偏振等許多物理參數(shù)，從各個(gè)角度反映了分子的成鍵和結(jié)構(gòu)情況。通過對(duì)這些參數(shù)的測(cè)定， 不但可以做一般的定量分析， 而且還可以推斷分子在各種環(huán)境下的構(gòu)象變化， 從而闡明分子結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。熒光分光光度計(jì)的激發(fā)波長掃描范圍一般是190~650nm，發(fā)射波長掃描范圍是200~800nm。可用于液體、固體樣品（如凝膠條）的光譜掃描。

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　　熒光分光光度計(jì)分類

　　熒光光譜法具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、用樣量少、方法簡便、工作曲線線形范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，可以廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)和藥理學(xué)、有機(jī)和無機(jī)化學(xué)等領(lǐng)域。

　　熒光分光光度計(jì)的發(fā)展經(jīng)歷了手控式熒光分光光度計(jì)，自動(dòng)記錄式熒光分光光度計(jì)，計(jì)算機(jī)控制式熒光分光光度計(jì)。

　　光分光光度計(jì)三個(gè)階段;熒光分光光度計(jì)還可分為單光束式熒光分光光度計(jì)和雙光束式熒光分光光度計(jì)兩大系列。其他的還有低溫激光Sh p ol’skill熒光分光光度計(jì)，配有壽命和相分辯測(cè)定的熒光分光光度計(jì)等。

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　　熒光分光光度計(jì)操作步驟

　　1.開機(jī)：接通電源，打開主機(jī)開關(guān)，點(diǎn)燃（打開）光源后，根據(jù)說明書要求啟動(dòng)計(jì)算機(jī)。

　　2.檢測(cè)前準(zhǔn)備：參照儀器說明書，在20天內(nèi)至少進(jìn)行一次激發(fā)校準(zhǔn)和發(fā)射校準(zhǔn)，檢測(cè)前儀器應(yīng)預(yù)熱。

　　3.工作條件的選擇：環(huán)境溫度應(yīng)在20℃±5℃;相對(duì)濕度不大于70%;電源穩(wěn)定，無磁場(chǎng)、電場(chǎng)干擾。根據(jù)樣品的特性及熒光強(qiáng)度，選擇合適的儀器工作條件（如狹縫、PM增益、響應(yīng)時(shí)間等）。

　　4.基本測(cè)定

　　（1）熒光激發(fā)光譜測(cè)定

　　設(shè)置儀器參數(shù)，掃描發(fā)射波長，找到maxλem，以此為發(fā)射波長，記錄發(fā)射強(qiáng)度作為激發(fā)波長的函數(shù)，便得到激發(fā)光譜。

　　（2）熒光發(fā)射光譜測(cè)定

　　設(shè)置儀器參數(shù)，掃描激發(fā)波長，找到maxλex，以此為激發(fā)波長，記錄發(fā)射強(qiáng)度與發(fā)射波長間的函數(shù)關(guān)系，便得到熒光發(fā)射光譜。

　　（3）差譜測(cè)定

　　設(shè)置儀器參數(shù)，選擇合適的工作方式，測(cè)定背景溶液的發(fā)射光譜并儲(chǔ)存起來，在一定的工作方式下，掃描樣品溶液的發(fā)射波長，得到當(dāng)時(shí)的光度值和儲(chǔ)存的背景值之間的差示值，即差譜。

　　（4）峰面積積分

　　選擇適當(dāng)?shù)墓ぷ鞣绞剑瑢?duì)樣品溶液進(jìn)行積分操作，即得到峰面積積分。

　　（5）熒光強(qiáng)度

　　選擇合適的測(cè)量參數(shù)，設(shè)置λex、λem，采用定點(diǎn)讀數(shù)或掃描方式，即可測(cè)得所選波長處的熒光強(qiáng)度。

　　（6）定量測(cè)定

　　配制一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在一定的測(cè)定條件下，設(shè)置λex、λem，按照由稀至濃的次序，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度，繪制熒光強(qiáng)度—濃度的工作曲線，不改變儀器參數(shù)測(cè)定未知溶液的熒光強(qiáng)度，由工作曲線即可求出未知溶液的濃度。