高效液相色譜法   (High Performance Liquid Chromatography，HPLC)  
       高效液相色譜法（HPLC）是20世紀60年代末70年代初發展起來的一種新型分離分析技術，隨著不斷改進與發展，目前已成為應用極為廣泛的化學分離分析的重要手段。它是在經典液相色譜基礎上，引入了氣相色譜的理論，在技術上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，因而具備速度快、效率高、靈敏度高、操作自動化的特點。為了更好地了解高效液相色譜法優越性，現從兩方面進行比較：
 1．高效液相色譜法與經典液相色譜法
      高效液相色譜法比起經典液相色譜法的最大優點在于高速、高效、高靈敏度、高自動化。高速是指在分析速度上比經典液相色譜法快數百倍。由于經典色譜是重力加料，流出速度極慢；而高效液相色譜配備了高壓輸液設備，流速最高可達 103cm·min-1.例如分離苯的羥基化合物，7個組分只需1min就可完成。對氨基酸分離，用經典色譜法，柱長約170cm，柱徑0.9cm，流動相速度為30cm3·h-1，需用20多小時才能分離出20種氨基酸；而用高效液相色譜法，只需lh之內即可完成。又如用25cm×0.46cm的Lichrosorb－ODS(5μ)的柱，采用梯度洗脫，可在不到0.5h內分離出尿中104個組分.
2．高效液相色譜法與氣相色譜法
    （l）氣相色譜法分析對象只限于分析氣體和沸點較低的化合物，它們僅占有機物總數的20％。對于占有機物總數近80％的那些高沸點、熱穩定性差、摩爾質量大的物質，目前主要采用高效液相色譜法進行分離和分析。
     (2)氣相色譜采用流動相是惰性氣體，它對組分沒有親和力，即不產生相互作用力，僅起運載作用。而高效液相色譜法中流動相可選用不同極性的液體，選擇余地大，它對組分可產生一定親和力，并參與固定相對組分作用的劇烈競爭。因此，流動相對分離起很大作用，相當于增加了一個控制和改進分離條件的參數，這為選擇最佳分離條件提供了極大方便。

       (3)氣相色譜一般都在較高溫度下進行的，而高效液相色譜法則經?？稍谑覝貤l件下工作。
            總之，高效液相色譜法是吸取了氣相色譜與經典液相色譜優點，并用現代化手段加以改進，因此得到迅猛的發展。目前高效液相色譜法已被廣泛應用于分析對生物學和醫藥上有重大意義的大分子物質，例如蛋白質、核酸、氨基酸、多糖類、植物色素、高聚物、染料及藥物等物質的分離和分析。

          高效液相色譜法的儀器設備費用昂貴，操作嚴格，這是它的主要缺點。
20-2 高效液相色譜儀
      高效液相色譜儀的結構示意見圖20-1，一般可分為4個主要部分：高壓輸液系統，進樣系統，分離系統和檢測系統。此外還配有輔助裝置：如梯度淋洗，自動進樣及數據處理等。其工作過程如下：首先高壓泵將貯液器中流動相溶劑經過進樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當注入欲分離的樣品時，流經進樣器貯液器的流動相將樣品同時帶入色譜柱進行分離，然后依先后順序進入檢測器，記錄儀將檢測器送出的信號記錄下來，由此得到液相色譜圖。

1．高壓輸液系統
      由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細，因此對流動相阻力很大，為使流動相較快流動，必須配備有高壓輸液系統。它是高效液相色譜儀最重要的部件，一般由儲液罐、高壓輸液泵、過濾器、壓力脈動阻力器等組成，其中高壓輸液泵是核心部件。對于一個好的高壓輸液泵應符合密封性好，輸出流量恒定，壓力平穩，可調范圍寬，便于迅速更換溶劑及耐腐蝕等要求。常用的輸液泵分為恒流泵和恒壓泵兩種。恒流泵特點是在一定操作條件下，輸出流量保持恒定而與色譜柱引起阻力變化無關；恒壓泵是指能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色譜系統阻力而變化，故保留時間的重視性差，它們各有優缺點。目前恒流泵正逐漸取代恒壓泵。恒流泵又稱機械泵，它又分機械注射泵和機械往復泵兩種，應用最多的是機械往復泵。

2．進樣系統
           高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約5～30cm），所以柱外展寬（又稱柱外效應）較突出。柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進樣系統、連接管道及檢測器中存在死體積。柱外展寬可分柱前和柱后展寬。進樣系統是引起往前展寬的主要因素，因此高效液相色譜法中對進樣技術要求較嚴。

3 分離系統——色譜柱
      色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長5～30cm，內徑為4～5mm，凝膠色譜柱內徑3～12mm，制備往內徑較大，可達25mm 以上。一般在分離前備有一個前置柱，前置柱內填充物和分離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經過前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過分離柱時不再洗脫其中固定相，保證分離技的性能不受影響。
          柱子裝填得好壞對柱效影響很大。對于細粒度的填料（＜20μm）一般采用勻漿填充法裝柱，先將填料調成勻漿，然后在高壓泵作用下，快速將其壓入裝有洗脫液的色譜柱內，經沖洗后，即可備用。
4．檢測系統
           在液相色譜中，有兩種基本類型的檢測器。一類是溶質性檢測器，它僅對被分離組分的物理或化學特性有響應，屬于這類檢測器的有紫外、熒光、電化學檢測器等。另一類是總體檢測器，它對試樣和洗脫液總的物理或化學性質有響應，屬于這類檢測器的有示差折光，電導檢測器等?，F將常用的檢測器介紹如下:
 
（l）紫外檢測器
（2）熒光檢測器
   (3)   示差折光率檢測器
           幾乎所有物質都有各自不同的折射率，因此差示折光檢測器是一種通用型檢測器。靈敏度可達10-7g·cm-3。主要缺點是對溫度變化敏感，并且不能用于梯度淋洗。
  （4）電導檢測器
    (5)   附屬系統
          它包括脫氣、梯度淋洗、恒溫、自動進樣、餾分收集以及數據處理等裝置。其中梯度淋洗裝置是高壓液相色譜儀中尤為重要的附屬裝置 . 
    20-3高效液相色譜的固定相和流動相
（－）固定相
            高效液相色譜固定相以承受高壓能力來分類，可分為剛性固體和硬膠兩大類。剛性固體以二氧化硅為基質，可承受7.O×108～1.O×109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。如果在二氧化硅表面鍵合各種官能團，就是鍵合固定相，可擴大應用范圍，它是目前最廣泛使用的一種固定相。硬膠主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯而成?？沙惺軌毫ι舷逓?.5×108Pa。固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔型固定相兩類。
1.表面多孔型固定相
          它的基體是實心玻璃珠，在玻璃球外面覆蓋一層多孔活性材料，如硅膠、氧化鋁、離子交換劑、分子篩、聚酸胺等。表面活性材料為硅膠的固定相如國外的Zpax，Corasil I和II，Vydac，Pellosil以及上海試劑一廠的薄殼玻璃珠等；表面活性材料為氧化鋁的固定相，如Pellumina；為聚酰胺的，如Pellion。這類固定相的多孔層厚度小、孔淺，相對死體積小，出峰迅速、柱效亦高；顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時能迅速達平衡，較適合做常規分析。由于多孔層厚度薄，最大允許量受限制。
2．全多孔型固定相
           它由直徑為10nm的硅膠微粒凝聚而成。如國外的Porasil，Zobbex、Lichrosorb系列，上海試劑一廠的堆積硅珠，青島海洋化工廠的YWG系列，天津試劑二廠的DG系列等。也可由氧化鋁微粒凝聚成全多孔型固定相，如國外的Lichrosorb ALOXT。這類固定相由于顆粒很細（5～10μm），孔仍然較淺，傳質速率快，易實現高效、高速。特別適合復雜混合物分離及痕量分析.
 
（二）流動相
     由于高效液相色譜中流動相是液體，它對組分有親和力，并參與固定相對組分的競爭。因此，正確選擇流動相直接影響組分的分離度。對流動相溶劑的要求是：
     （1）溶劑對于待測樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性。
     （2）溶劑要與檢測器匹配。對于紫外吸收檢測器，應注意選用檢測器波長比溶劑的紫外截止波長要長。所謂溶劑的紫外截止波長指當小于截止波長的輻射通過溶劑時，溶劑對此輻射產生強烈吸收，此時溶劑被看作是光學不透明的，它嚴重干擾組分的吸收測量。表20-2列出了一些常用溶劑的紫外截止波長。
     對于折光率檢測器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動相，以達最高靈敏度。
高效液相色譜法的主要類型及選擇
（－）液一液分配色譜法（LLPC）
          在液-液色譜中,流動相和固定相都是液體,它能適用于各種樣品類型的分離和分析，無論是極性的和非極性的，水溶性和油溶性的，離子型的和非離子型的化合物。
1．分離原理
    液液分配色譜的分離原理基本與液液萃取相同，都是根據物質在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不同的分配系數。所不同的是液液色譜的分配是在柱中進行的，使這種分配平衡可反復多次進行，造成各組分的差速遷移，提高了分離效率，從而能分離各種復雜組分。
 
2固定相
          由于液液色譜中流動相參與選擇競爭，因此，對固定相選擇較簡單。只需使用幾種極性不同的固定液即可解決分離問題。例如，最常用的強極性固定液β，β′一氧二丙睛，中等極性的聚乙二醇，非極性的角鯊烷等。
           為了更好解決固定液在載體上流失問題。產生了化學鍵合固定相。它是將各種不同有機基團通過化學反應鍵合到載體表面的一種方法。它代替了固定液的機械涂漬，因此它的產生對液相色譜法迅速發展起著重大作用，可以認為它的出現是液相色譜法的一個重大突破。它是目前應用最廣泛的一種固定相。據統計，約有3/4以上的分離問題是在化學鍵合固定相上進行的。詳細介紹見后。

3．流動相
           在液液色譜中為了避免固定液的流失。對流動相的一個基本要求是流動相盡可能不與固定相互溶，而且流動相與固定相的極性差別越顯著越好。根據所使用的流動相和固定相的極性程度，將其分為正相分配色譜和反相分配色譜。如果采用流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相分配色譜，它適用于極性化合物的分離。其流出順序是極性小的先流出，極性大的后流出。如果采用流動相的極性大于固定相的極性，稱為反相分配色譜。它適用于非極性化合物的分離，其流出順序與正相色譜恰好相反。
（二）化學鍵合相色譜法（CBPC）
         采用化學鍵合相的液相色譜稱為化學鍵合相色譜法，簡稱鍵合相色譜。由于鍵合固定相非常穩定，在使用中不易流失，適用于梯度淋洗，特別適用于分離容量因子k值范圍寬的樣品。由于鍵合到載體表面的官能團可以是各種極性的，因此它適用于種類繁多樣品的分離。
1．鍵合固定相類型
    用來制備鍵合固定相的載體，幾乎都用硅膠。利用硅膠表面的硅醇基(Si一OH)與有機分可成鍵,即可得到各種性能的固定相。一般可分三類
（1）疏水基團  如不同鏈長的烷烴（C8和C18。）和苯基等
（2）極性基團  如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。
（3）離子交換基團  如作為陰離子交換基團的胺基，季鍍鹽；
     作為陽離子交換 基團的磺酸等.

2．鍵合固定相的制備
（l）硅酸酯（≡Si一OR）鍵合固定相,它是最先用于液相色譜的健合固定相。用醇與硅醇基發生酯化反應：
       ≡Si－0H＋ROH→≡Si－OR＋H20
由于這類鍵合固定相的有機表面是一些單體，具有良好的傳質特性,但這些酯化過的硅膠填料易水解且受熱不穩定，因此僅適用于不含水或醇的流動相。
（2）≡Si－C或Si一N共價鍵合固定相
       制備反應如下

           共價鍵健合固定相不易水解，并且熱穩定較硅酸酯好。缺點是格氏反應不方便；當使用水溶液時，必須限制PH在4～8范圍內.

（3）硅烷化（≡Si—O－Si－C）鍵合固定相
制備反應如下：
3．反相健合相色譜法
            此法的固定相是采用極性較小的鍵合固定相，如硅膠一C18H37、硅膠一苯基等；流動相是采用極性較強的溶劑，如甲醇十、乙睛一水、水和無機鹽的緩沖溶液等。它多用于分離多環芳烴等低極性化合物；若采用含一定比例的甲醇或乙睛的水溶液為流動相，也可用于分離極性化合物；若采用水和無機鹽的緩沖液為流動相，則可分離一些易離解的樣品，如有機酸、有機堿、酚類等。反相鍵合相色譜法具有柱效高，能獲得無拖尾色譜峰的優點。
            關于反相鍵合相色譜的分離機理，可用所謂疏溶劑作用理論來解釋。這種理論把非極性的烷基鍵合相看作一層鍵合在硅膠表面上的十八烷基的“分子毛”，這種“分子毛”有較強的流水特性。當用極性溶劑為流動相來分離含有極性官能團的有機化合物時，一方面，分子中的非極性部分與固定相表面上的疏水烷基產生締合作用，使它保留在固定相中；而另一方面，被分離物的極性部分受到極性流動相的作用，促使它離開固定相，并減小其保留作用（見圖20-4）。顯然，兩種作用力之差，決定了分子在色譜中的保留行為。

4.正相鍵合相色譜法
            此法是以極性的有機基團，CN、NH2雙羥基等鍵合在硅膠表面，作為固定相；而以非極性或極性小的溶劑（如烴類）中加入適量的極性溶劑（如氯仿、醇、乙臘等）為流動相，分離極性化合物。此時，組分的分配比k值隨其極性的增加而增大，但隨流動相極性的增加而降低。
            這種色譜方法主要用于分離異構體、極性不同的化合物，特別適用于分離不同類型的化合物。
5.離子性鍵合相色譜法
      當以薄殼型或全多孔微粒型硅膠為基質，化學鍵合各種離子交換基團，如一SO3H 一CH2NH2、－C00H、一CH2N（CH3）等時，就形成了離子性鍵合相色譜的固定相；流動相一般采用緩沖溶液。其分離原理與離子交換色譜類同。
     以上討論了各種類型化學鍵合相色譜法，歸納鍵合相色譜的最大優點是：通過改變流動相的組成和種類，可有效地分離各種類型化合物（非極性、極性和離子型）。此外，由于鍵合到載體上的基團不易流失，特別適用于梯度淋洗。據統計，在高效液相色譜法中，約有8O％的分離問題是用鍵合相色譜法解決。此法的最大缺點是不能用于酸、堿度過大或存在氧化劑的緩沖溶液作流動相的體系。如何根據樣品極性種類來選擇化學鍵合的固定相，請參看表20-3。
 
（三）液一固吸附色譜法(LSAC)
          液一固吸附色譜是以固體吸附劑作為固定相，吸附劑通常是些多孔的固體顆粒物質，在它們的表面存在吸附中心。液固色譜實質是根據物質在固定相上的吸附作用不同來進行分離的。
1．分離原理
            當流動相通過固定相（吸附劑）時，吸附劑表面的活性中心就要吸附流動相分子。同時，當試樣分子（X）被流動相帶入柱內，只要它們在固定相有一定程度的保留就要取代數目相當的已被吸附的流動相溶劑分用）于是，在固定相表面發生競爭吸附:
              X + nSad = Xad + nS
 
達平衡時,有
2．固定相
      吸附色譜所用固定相多是一些吸附活性強弱不等的吸附劑，如硅膠、氧化鋁、聚酸膠等。由于硅膠的優點較多，如線性容量較高，機械性能好，不溶脹，與大多數試樣不發生化學反應等，因此，以硅膠用得最多。
    在高效液相色譜法中，表面多孔型和全多孔型都可作吸附色譜中的固定相，它們具有填料均勻、粒度小。孔穴淺的優點，能極大地提高柱效。但表面多孔型由于試樣容量較小，目前最廣泛使用的還是全多孔型微粒填料。
3流動相
            一般把吸附色譜中流動相稱作洗脫劑。在吸附色譜中對極性大的試樣往往采用極性強的洗脫劑；對極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑。洗脫劑的極性強弱可用溶劑強度參數（ε0）來衡量。ε0越大，表示洗脫劑的極性越強。表20-4列出一些常用溶劑在氧化鋁吸附劑中的ε0值。在硅膠吸附劑中ε0值的順序相同，數值可換算（ε0硅膠=0·77×ε0氧化鋁）。

(四）離子交換色譜法（IEC）
           此法是利用離子交換原理和液相色譜技術的結合來測定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法。凡在溶液中能夠電離的物質，通常都可用離子交換色譜法進行分離。它不僅適用無機離子混合物的分離，亦可用于有機物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質等生物大分子。因此，應用范圍較廣。

1．離子交換原理
    離子交換色譜法是利用不同待測離子對固定相親和力的差別來實現分離的。其固定相采用離子交換樹脂，樹脂上分布有固定的帶電荷基團和可游離的平衡離子。當待分析物質電離后產生的離子可與樹脂上可游離的平衡離子進行可逆交換，其交換反應通式如下：
陽離子交換：
達平衡時，以濃度表示的平衡常數（離子交換反應的選擇系數）：
     式中[A]r，[B]r 分別代表樹脂相中洗脫劑離子（A）和試樣離子（B）的濃度，[A]、[B]則代表它們在溶液中的濃度。離子交換反應的選擇性系數見從表示試樣離子B對于A型樹脂親和力的大?。篕B/A越大，說明B離子交換能力越大，越易保留而難于洗脫。一般說來，B離子電荷越大，水合離子半徑越小，KB/A值就越大。
 
對于典型的磺酸型陽離子交換樹脂，一價離子的KB/A值按以下順序：
Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li+
二價離子的順序為：
    Ba2+＞Pb2+＞Sr2+＞Ca2+＞Cd2+＞Cu2+，Zn2+＞Mg2+
對于季鋁型強堿陰離子交換樹指，各陰離子的選擇性順序為：
   ClO4-＞I-＞HS04-＞SCN-＞NO2-＞Br-＞CN-＞Cl-＞BrO3-＞OH-
        ＞HCO3-＞H2P04-＞IO3-＞CH3COO－＞F－

2．固定相
          作為固定相的離子交換劑，其基質大致有三大類：合成樹脂（聚苯乙烯）、纖維素和硅膠。而離子交換劑又有陽離子和陰離子之分。再根據官能基的離解度大小還有強弱之分（見表20-5）
        常用的離子交換劑固定相大致可分以下幾種：
（l）多孔型離子交換樹脂
它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交聯聚合物，直徑約為5～20μm，有微孔型和大孔型之分[見圖20-6中（a）和（b）］。
（2）薄膜型離子交換樹脂
它是在直徑約對30μm的固體情性核上，凝聚1～2μm厚的樹脂層，如圖20-6中（c）。
（3）表面多孔型離子交換樹脂
    它是在固體情性核上，覆蓋一層微球硅膠，再在上面涂一層很薄的離子交換樹脂，如圖20-6中（d）所示。
（4）離子交換鍵合固定相
       它是用化學反應將離子交換基團鍵合到惰性載體表面。它也分為兩種類型。一種是鍵合薄殼型，其載體是薄殼玻珠。另一種是鍵合微粒載體型，它的載體是多孔微粒硅膠。后者是一種優良的離子交換固定相，它的優點是機械性能穩定，可使用小粒度固定相和高柱壓來實現快速分離。
3．流動相
     離子交換色譜法所用流動相大都是一定pH和鹽濃度（或離子強度）的緩沖溶液。通過改變流動相中鹽離子的種類、濃度和pH值可控制k值，改變選擇性。如果增加鹽離子的濃度，則可降低樣品離子的競爭吸附能力，從而降低其在固定相上的保留值。
        一般，對于陰離子交換樹脂來說，各種陰離子的滯留次序為：
檸檬酸離子＞SO42－＞C2O42-＞I-＞NO3-＞CrO42-＞Br-＞SCN-＞
                              Cl-＞HCOO-＞CH3C00-＞OH-＞F-
所以用檸檬酸離子洗脫要比用氟離子快。陽離子的滯留次序大為：
              Ba2+＞Pb2+＞Ca2+＞Ni2+＞Cd2+＞Cu2+＞Co2+＞Zn2+＞Mg＞
                    Ag+＞Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li十
     但差別不如陰離子明顯。關于pH值的影響，要視不同情況而定。例如，分離有機酸和有機堿時，這些酸堿的離解程度可通過改變流動相的pH值來控制。增大pH值會使酸的電離度增加，使堿的電離度減少；降低PH值，其結果相反。但無論屬于哪種情況，只要電離度增大，就會使樣品的保留增大。
（五）離子色譜法（IC）
            離子色譜法是由離子交換色譜法派生出來的一種分離方法。由于離子交換色譜法在無機離子的分析和應用受到限制。例如，對于那些不能采用紫外檢測器的被測離子，如采用電導檢測器，由于被測離子的電導信號被強電解質流動相的高背景電導信號掩沒而無法檢測。為了解決這一問題，1975年Small等人提出一種能同時測定多種無機和有機離子的新技術。他們在離子交換分離柱后加一根抑制柱，抑制柱中裝填與分離柱電荷相反的離子交換樹脂。通過分離柱后的樣品再經過抑制柱，使具有高背景電導的流動相轉變成低背景電導的流動相，從而用電導檢測器可直接檢測各種離子的含量。這種色譜技術稱為離子色譜。若樣品為陽離子，用無機酸作流動相，抑制柱為高容量的強堿性陰離子交換劑。當試樣經陽離子交換劑的分離往后，隨流動相進入抑制柱，在抑制柱中發生兩個重要反應：

R+－OH＋H+Cl- -→R+－Cl十H2O
R+一OH-＋M+Cl--→M+OH－＋R+－Cl-
            由反應可見：經抑制柱后，一方面將大量酸轉變為電導很小的水，消除了流動相本底電導的影響。同時，又將樣品陽離子M+轉變成相應的堿，由于OH-離子的淌度為Cl-離子的2．6倍，提高了所測陽離子電導的檢測靈敏度。對于陰離子樣品也有相似的作用機理。
             在分離柱后加一個抑制柱的離子色譜亦稱為抑制型離子色譜或稱雙柱離子色譜。由于抑制柱要定期再生，而且譜帶在通過抑制柱后會加寬，降低了分離度。后來，Frits等人提出采用抑制柱的離子色譜體系，而采用了電導率極低的溶液，例如1×10-4～5×10-4mol·dm-3苯甲酸鹽或鄰苯二甲酸鹽的稀溶液作流動相，稱為非抑制型離子色譜或單柱離子色譜。
（六）離子對色譜法（IPC）
            離子對色譜法是分離分析強極性有機酸和有機堿的極好方法。它是離子對革取技術與色譜法相結合的產物。在20世紀7O年代中期，Schill等人首先提出離子對色譜法，后來，這種方法得到十分迅速的發展。
1．離子對色譜法原理
            離子對色譜法是將一種（或數種）與溶質離子電荷相反的離子（稱對離子或反離子）加到流動相或固定相中，使其與溶質離子結合形成離子對，從而控制溶質離子保留行為的一種色譜法。關于離子對色譜機理，至今仍不十分明確，已提出三種機理：離子對形成機理；離子交換機理；離子相互作用機理?，F以離子對形成機理說明之。假如有一離子對色譜體系，固定相為非極性鍵合相，流動相為水溶液，并在其中加入一種電荷與組分離子A-相反的離子B+，B+離子由于靜電引力與帶負電的人組分離子生成離子對化合物A-B+。離子對生成反應式 

   由于離子對化合物A-B+具有疏水性，因而被非極性固定相（有機相）提取。組分離子的性質不同，它與反離子形成離子對的能力大小不同以及形成的離子對流水性質不同，導致各組分離子在固定相中滯留時間不同，因而出峰先后不同。這就是離子對色譜法分離的基本原理。
2．鍵合相反相離子對色譜法
            離子對色譜法類型很多，根據流動相和固定相的極性可分為反相離子對和正相離于對色譜法。其中以鍵合相離子對色譜法最重要。這種色譜法的固定相采用非極性的疏水鍵合相［如十八烷基鍵合相（ODS）等］，流動相為加有平衡離子（反離子）的極性溶液（如甲醇一水或乙睛一水）。
        根據離子對生成反應式，平衡常數 KAB可表示為
根據上兩式，有
式中β為相比率。容量因子k隨KAB和[B+]水相的增大而增大。
            鍵合相反相離子對色譜法操作簡便，只要改變流動相的pH值、平衡離子的濃度和種類，就可在較大范圍內改變分離的選擇性，能較好解決難分離混合物的分離問題。此法發展迅速，應用較廣泛.
（七）尺寸排阻色譜法（SEC）
      尺寸排阻色譜法又稱凝膠色譜法，主要用于較大分子的分離。與其他液相色譜方法原理不同，它不具有吸附、分配和離子交換作用機理，而是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來實現分離的。
      尺寸排阻色譜被廣泛應用于大分子的分級，即用來分析大分子物質相對分子質量的分布。它具有其他液相色譜所沒有的特點：（1）保留時間是分子尺寸的函數，有可能提供分子結構的某些信息。(2)保留時間短，譜峰窄，易檢測，可采用靈敏度較低的檢測器（3）固定相與分子間作用力極弱，趨于零。由于柱子不能很強保留分子，因此柱壽命長。（4）不能分辨分子大小相近的化合物，相對分子質量差別必須大于10％才能得以分離。
1．分離原理
           尺寸排阻色譜是按分子大小順序進行分離的一種色譜方法。其固定相為化學情性多孔物質——凝膠，它類似于分子篩，但孔徑比分子篩大。凝膠內具有一定大小的孔穴，體積大的分子不能滲透到孔穴中去而被排阻，較早地被淋洗出來；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內，最后洗出色譜柱。這樣，樣品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。其滲透過程模型見圖20-7。
2．固定相
         排阻色譜固定相種類很多，一般可分為軟性、半剛性和剛性凝膠三類。表20-6列出了常用的一些固定相。
             所謂凝膠，指含有大量液體（一般是水）的柔軟而富于彈性的物質，它是一種經過交聯而具有立體網狀結構的多聚體。
    （1）軟性凝膠   如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠都具有較小的交聯結構，其微孔能吸入大量的溶劑，并能溶脹到它們干體的許多倍。它們適用以水溶性溶劑作流動相，一般用于小分子質量物質的分析，不適宜用在高效液相色譜中。
    （2）半剛性凝膠  如高交聯度的聚苯乙烯（Styragel）比軟性凝膠稍耐壓，溶脹性不如軟性凝膠。常以有機溶劑作流動相。用于高效液相色譜時，流速不宜大。
    （3）剛性凝膠   如多孔硅膠、多孔玻璃等它們既可用水溶性溶劑，又可用有機溶劑作流動相，可在較高壓強和較高流速下操作。一般控制壓強小于7MPa，流速＜1cm3·s-1；否則將影響凝膠孔徑，造成不良分離。
3．流動相     排阻色譜所選用的流動相必須能溶解樣品，并必須與凝膠本身非常相似，這樣才能潤濕凝膠。當采用軟性凝膠時，溶劑也必須能溶脹凝膠。另外，溶劑的粘度要小，因為高粘度溶劑往往限制分子擴散作用而影響分離效果。這對于具有低擴散系數的大分子物質分離，尤需注意。選擇溶劑還必須與檢定器相匹配。常用的流動相有四氫呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。        以水溶液為流動相的凝膠色譜適用于水溶性樣品，以有機溶劑為流動相的凝膠色譜適用于非水溶性樣品。
(八)親和色譜法（AC）簡介
             親和色譜是利用生物大分子和固定相表面存在某種特異性親和力，進行選擇性分離的一種方法。它通常是在載體（無機或有機填料）表面先鍵合一種具有一般反應性能的所謂間隔臂（如環氧、聯氨等）；隨后，再連接上配基（酶、抗原或激素等）。這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子相互作用而被保留，沒有這種作用的分子不被保留。圖20-9為親和色譜法示意圖。
（九）分離類型的選擇
1．根據相對分子質量選擇
      相對分子質量十分低的樣品，其揮發性好，適用于氣相色譜。標準液相色譜類型（液一固、液一液、及離子交換色譜）最適合的相對分子質量范圍是20O～2000。對于相對分子質量大于2000的樣品，則用尺寸排阻法為最佳。
2．根據溶解度選擇
      弄清樣品在水、異辛烷、苯、四氯化碳、異丙醇中的溶解度是很有用的。如果樣品可溶于水井屬于能離解物質，以采用離子交換色譜為佳；如樣品可溶于烴類（如苯或異辛烷），則可采
       表  20-7液相色譜分離類型選擇參考表
                                     溶于水——排阻色譜，水為流動相
          相對分子質量
               ＞2000          不溶于水——排阻色譜，非水流動相
                                                        同系物——分配色譜
                                    不溶于水    異構體——吸附色譜
樣品                                                分子大小差異——排阻色譜
                                                                   反相液一液色譜
          相對分子質量   溶于水，不離解 
              ＜2000                                         排阻色譜，水為流動相
                                                                   堿——陽離子交換色譜
                                    溶于水，可離解
                                                                   酸——陰離子交換色譜
                                    溶于水，     離子與非離子—反相離子對色譜
        用液一固吸附色譜；如樣品溶解于四氯化碳，則多采用常規的分配和吸附色譜分離；如樣品既溶于水又溶于異丙醇時，常用水和異丙醇的混合液作液一液分配色譜的流動相，以憎水性化合物作固定相。
 
思考題
1．現需分離分析一氨基酸試樣，擬采用哪種色譜？
2．提高液相色譜中柱效的最有效途徑是什么？
3.   何謂反相液相色譜？何謂正相液相色譜？
4.  在液相色譜法中，梯度淋洗適用于分離何種試樣？
5. 在液相色譜中，范氏方程中的哪一項對柱效能的影響可以忽 略不計？(p369)
6. 對下列試樣，用液相色譜分析，應采用何種檢測器：
 （l）長鏈飽和烷烴的混合物  （2）水源中多環芳烴化合物。
7. 對聚苯乙烯相對分子質量進行分級分析，應采用哪一種液相色譜法？
8．什么是化學鍵合固定相？它的突出優點是什么？
9．什么叫梯度洗脫？它與氣相色譜中的程序升溫有何異同？
10.指出下列各種色譜法，最適宜分離的物質。
  （l）氣液色譜；(2) 正相色譜；（3）反相色譜；（4）離子交
     換 色譜;（5）凝膠色譜；(6）氣固色譜；(7）液固色譜。