真菌毒素是由霉菌產生的一類次生代謝產物，廣泛分布于自然界中，尤其在食品中較為常見。當人類和動物通過食物攝入真菌毒素時，會導致身體功能下降，引發(fā)各種疾病甚至死亡。其中，黃曲霉毒素B1（AFB1）的毒性最強，污染范圍最廣，且能夠阻止細胞中RNA合成，在很大程度上增加人類和動物肝硬化、壞死和癌癥的風險，已被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機構歸為I類致癌物。因此，發(fā)展快速、準確、高效的AFB1檢測技術，及時發(fā)現(xiàn)食品安全隱患，切實保障食品安全具有重要意義。
近期，麻省理工學院及賓夕法尼亞大學研究人員利用聚集誘導發(fā)光（AIE）分子（TPE-Z）作為熒光探針，以Cy5標記的核酸適配體作為識別元件，以氧化石墨烯（GO）作為熒光淬滅劑構建雙色熒光信號傳感器。當體系中引入黃曲霉毒素（AFB1）后，傳感器的熒光信號從“關”變?yōu)椤伴_”，輸出兩個熒光信號。通過監(jiān)測TPE-Z（480 nm）和Cy5（670 nm）的熒光信號變化，可實現(xiàn)對玉米、大米和大豆等食物樣品中AFB1的快速而準確的檢測。相關研究成果以“Construction of AIEgens and graphene oxide based aptasensor with two-fluorescent signals for determination of Aflatoxin B1 in food Samples”為題發(fā)表于期刊Giant。
該工作涉及兩種熒光染料，其中一種為標記在AFB1適配體5’端的發(fā)紅光的熒光染料Cy5（670 nm），另外一種為帶有正電荷且具有水溶性的聚集誘導發(fā)光分子TPE-Z（480 nm）。在水溶液體系中，TPE-Z處于分散狀態(tài)，背景熒光信號較低，TPE-Z帶正電荷可通過靜電吸附作用力，聚集在DNA磷酸骨架上，發(fā)出熒光信號。
由于熒光共振作用，TPE-Z的熒光點亮Cy5熒光，輸出雙色熒光信號。此外，將氧化石墨烯（GO）引入反應體系中，由于靜電作用力和π-π堆積作用力，復合物TPE-Z/Cy5核酸適配體吸附在GO表面，此時TPE-Z分子熒光被淬滅；當有AFB1存在時，Cy5核酸適配體特異性識別靶標分子AFB1，形成二級結構，從GO表面解吸附。此時TPE-Z熒光釋放，同時點亮Cy5熒光，通過監(jiān)測TPE-Z和Cy5的熒光信號，可實現(xiàn)對目標分子AFB1的高靈敏檢測，相對于單一信號輸出檢測傳感器，該雙色熒光信號輸出傳感器檢測特異性強且靈敏度高（圖1）。
圖1 雙色熒光信號檢測傳感器檢測黃曲霉毒素AFB1示意圖
為了驗證該傳感器檢測AFB1的性能，研究人員實施了一系列驗證實驗。如圖2所示，GO與單鏈核酸分子之間通過π-π堆積作用組裝成GO/DNA復合物，該結合作用拉近了探針上的熒光基團與GO表面的距離，從而導致能量轉移現(xiàn)象的出現(xiàn)，最終完成了GO對熒光基團的淬滅效應。隨著GO濃度的增大，TPE-Z和Cy5的熒光強度急劇下降，當GO的濃度達到25 μg/mL時，大部分熒光被淬滅。
圖2 雙色熒光信號檢測傳感器對不同濃度氧化石墨烯（GO）（0~40 μg/mL）的熒光響應曲線
當體系中存在靶標分子AFB1時，核酸適配體特異性識別AFB1并折疊形成二級結構，與GO之間弱的結合能力，導致熒光基團TPE-Z和Cy5遠離淬滅劑表面，熒光信號恢復（圖3）。
圖3 雙色熒光信號檢測傳感器對黃曲霉毒素B1（AFB1）和不同反應時間熒光信號響應
如圖4所示，隨著靶標分子AFB1量的增多，TPE-Z和Cy5的熒光強度也逐漸增強，在線性范圍為0.005~300 ng/mL時，最低檢測限可低至0.04 ng/mL，遠遠低于單一信號輸出檢測傳感器，證明該雙色熒光信號輸出傳感器具有較高檢測靈敏度。
圖4 雙色熒光信號檢測傳感器檢測黃曲霉毒素B1（AFB1）濃度熒光譜圖和線性曲線
食物中存在很多種真菌毒素，對檢測體系具有一定的干擾作用，核酸適配體對靶標分子的特異性識別功能，對其它真菌毒素不具有或識別功能較弱。如圖5所示，在有靶標分子AFB1存在時，TPE-Z和Cy5的熒光信號大幅增強，而對其它與AFB1結構相似且在食物種普遍存在的真菌毒素如赭曲霉毒素（OTA）和玉米赤霉素烯酮（ZEN）不具有熒光信號響應功能，說明該雙色熒光信號輸出傳感器對AFB1具有高特異性檢測功能。
圖5 雙色熒光信號輸出檢測傳感器對黃曲霉毒素B1（AFB1）、赭曲霉毒素（OTA）和玉米赤霉素烯酮（ZEN）的熒光信號響應和圓二色譜圖
為了驗證該雙色熒光信號輸出檢測傳感器檢測AFB1的適用性和可靠性，研究人員將該傳感器應用于玉米、大米和大豆等食物樣品中AFB1檢測。如表2所示，食物樣本提取液中未檢測到AFB1，而向食物樣本提取液中摻雜1.00 ng/mL和1.68 ng/mL的AFB1，得到92.3%~108.7%的回收率，與商業(yè)中廣泛使用的HPLC法檢測結果相吻合，該統(tǒng)計結果說明該雙色熒光信號輸出檢測傳感器能有效的用于食物樣品中AFB1的追蹤分析。
表2 雙色熒光信號輸出檢測傳感器檢測食物提取液中黃曲霉毒素B1（AFB1）：a）測定值均值；b）標準差；c）?未檢測出黃曲霉毒素（AFB1）
審核編輯：劉清